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丹参茎叶总酚酸及与丹参酮联用组分对炎症性肠病的干预作用与机理研究

彭珂毓  
【摘要】:本论文在国家自然科学基金项目“丹参茎叶改善血液循环和调控炎症反应的效应物质基础与分子机制研究”(81673533)和江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目(ZDXM-2-5)的支持下完成。在前期研究的基础上,主要围绕丹参茎叶酚酸组分和丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病的干预作用与作用机理等进行研究,以期为丹参茎叶酚酸的进一步开发利用提供科学依据。主要研究内容及结果简述如下:一、文献研究本章通过查阅文献,系统地归纳了对炎症性肠病发病机制的认识,主要从环境因素、肠道微生物、免疫异常和宿主遗传易感性等方面总结了这些因素与炎症性肠病发生发展的作用关系,以助于探寻炎症性肠病的针对性治疗药物。中药治疗炎症性肠病多以清热药、活血化瘀药、补虚药及化湿药为主,其中又多以中药活性单体成分研究为主,体现了中医药治疗炎症性肠病丰富的临床及临床前研究,显示出极大的研究潜力,以期为从中药中开发研制副作用较小而疗效肯定的抗炎症性肠病药物提供研究思路。二、丹参茎叶酚酸组分对炎症性肠病小鼠模型的干预作用及机理研究1丹参茎叶总酚酸样品的制备丹参茎叶样品通过乙醇回流提取,经柱层析结合萃取技术纯化富集后制备得到丹参茎叶总酚酸。采用超高效液相方法对制备得到的丹参茎叶总酚酸中原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-0-芸香糖苷及紫云英苷等酚酸黄酮类成分进行含量测定,测得含量分别为1.54mg·g-1、298.43 mg·g-1、14.38mg·g-1、315.73 mg·g-1、7.30 mg·g-1、16.45 mg·g-1、6.10 mg·g-1、7.05 mg·g-1、3.07 mg·g-1 和2.45 mg·g-1,其中酚酸类成分总量为653.83 mg·g-1,黄酮类成分总量为18.67 mg·g-1。2丹参茎叶酚酸组分对炎症性肠病小鼠模型的有效性评价采用自由饮用2%(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)连续7天以建立结肠炎小鼠模型。造模成功后,丹参茎叶酚酸组分(包括丹参茎叶总酚酸及其中所含主要组分丹酚酸B、迷迭香酸和丹酚酸B+迷迭香酸)灌胃给药7天。给药期间记录小鼠疾病活动指数(DAI)评分,给药结束后,迅速剖取结肠进行长度测量和病理分析,以评价丹参茎叶酚酸组分对结肠炎模型小鼠的保护作用。结果显示,模型组小鼠DAI评分在停止饮用2%DSS溶液期间仍显著高于正常对照组(P0.001)。与正常对照组相比,模型组小鼠结肠长度明显缩短(P0.001),结肠组织出现严重的病理损伤(P0.05)。丹参茎叶酚酸组分给药干预后,上述情况得到不同程度的改善,表现出对结肠炎的保护治疗作用。3丹参茎叶酚酸组分对炎症性肠病小鼠模型的作用机制研究(1)丹参茎叶酚酸组分对炎症性肠病小鼠模型的免疫屏障改善作用利用ELISA和qPCR法检测结肠组织中炎症相关因子蛋白及基因表达水平,研究丹参茎叶酚酸组分对结肠炎症状态下的细胞因子网络的影响,探讨其对免疫屏障的调节作用。结果显示,与正常对照组相比,模型组中小鼠结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β,COX2和iNOS水平显著增加(P0.05),抗炎因子IL-10水平显著降低(P0.05);IL-6、COX2和IL17A mRNA水平显著升高(P0.01)。丹参茎叶酚酸组分干预后,除对TNF-α水平无明显抑制作用外,其他指标均得到不同程度的调节,表现出降低促炎因子蛋白及基因表达水平及增加抗炎因子蛋白水平从而恢复促炎因子与抗炎因子之间的平衡达到对结肠炎的保护作用,其中丹酚酸B+迷迭香酸和迷迭香酸表现出相似或比丹参茎叶总酚酸更好的作用效果。(2)丹参茎叶酚酸组分对炎症性肠病小鼠模型的肠道菌群调节研究采用16s rRNA基因测序技术研究丹参茎叶酚酸组分对结肠炎模型小鼠肠道菌群结构的影响。PCoA分析结果显示,丹参茎叶酚酸组分一定程度的调节结肠炎模型小鼠菌群结构异常和缩短得分图中距离正常对照组的RD值,其中迷迭香酸和丹酚酸B+迷迭香酸的作用相对较优为丹参茎叶总酚酸的活性组分,从整体肠道菌群角度揭示了丹参茎叶酚酸组分对结肠炎的保护作用。进一步通过LEfse分析发现,与正常对照组相比,模型组小鼠从门到种水平都存在显著差异菌群。丹参茎叶酚酸组分干预后主要下调变形菌门、埃希杆菌-志贺杆菌属(Escherichia_Shigella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Steptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和Parabacteroides_distasonis 相 对 丰 度,上 调 Odoribacter 和 瘤 胃 菌 属(Ruminococcaceae_UCG_013和Ruminiclostridium_6)相对丰度,尤其对潜在致病菌(链球菌属、肠球菌属、葡萄球菌属和大肠杆菌)相对丰度降低作用最为明显,达到对肠道菌群紊乱的调节作用。(3)丹参茎叶酚酸组分对炎症性肠病小鼠模型的代谢组学研究基于UPLC-Orbitrap MS技术,进行血清及盲肠内容物非靶向代谢组学分析。PLS-DA分析结果发现,丹参茎叶酚酸组分干预后,位于正常对照组和模型组之间并明显缩短RD值,显示出对异常血清及粪便代谢的调节作用。其中丹酚酸B+迷迭香酸调节作用相对较优是丹参茎叶总酚酸的活性组分,从整体代谢组学层面来揭示了丹参茎叶酚酸组分对结肠炎的保护作用。进一步对模型组中被显著扰乱的代谢物分析发现,丹参茎叶酚酸组分对鉴定出的35个内源性生物标志物(其中血清中9个,粪便中26个)不同程度向正常对照组水平回调。这些内源性生物标志物主要涉及甘油磷脂代谢、氨基酸代谢和嘌呤代谢。此外,通过相关分析发现结肠炎模型小鼠肠道菌群的异常波动与肠道内代谢物高度相关。丹参茎叶酚酸组分可通过下调副拟杆菌属的丰度来抑制芳香族氨基酸代谢并增加氨基酸水平,上调瘤胃菌属的丰度来促进胆汁酸代谢并增加胆汁酸水平,从而重塑肠道内环境稳态。三、丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病小鼠模型的干预作用及机理研究1丹参酮样品的成分分析采用高效液相方法对丹参酮提取物进行含量测定,共测得丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量分别为623.63 mg·g-1和47.42 mg·g-1,丹参酮总量为671.05 mg·g-1。2丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病小鼠模型的有效性评价同上一章,采用2%DSS建立结肠炎小鼠模型。造模成功后,丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用(包括丹参茎叶总酚酸、丹参酮及丹参茎叶总酚酸+丹参酮)给药干预7天。同样通过小鼠DAI评分,结肠长度,结肠病理损伤及组织学评分等指标,以评价丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对结肠炎模型小鼠的保护作用。结果显示,与模型组相比,丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用给药结束后均显著降低DAI评分,缓解结肠缩短,减轻结肠炎症损伤并下调组织学评分,表现出对结肠炎的保护治疗作用,其中低剂量的丹参茎叶总酚酸+丹参酮组的作用相对优于丹参茎叶总酚酸组显示出明显的协同效应。3丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病小鼠模型的作用机理研究(1)丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病小鼠模型的免疫屏障改善作用利用ELISA和qPCR法检测结肠组织中促炎因子蛋白及基因表达水平及Western blot法检测结肠组织中TLR4/PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白及STAT3蛋白表达的变化,研究丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用干预后对肠道炎症的缓解作用,以探讨其对免疫屏障的改善作用。结果显示,与正常对照组相比,模型组小鼠结肠组织中TLR4、mTOR、p-mTOR和NF-KBp65蛋白表达水平及PI3Kp110α、AKT(ser473)和STAT3磷酸化水平显著上调(P0.01),并伴随着促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1α和COX2水平以及IL-1β和iNOS mRNA水平显著升高(P0.05),表明TLR4/PI3K/AKT/mTOR通路及STAT3被激活。丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用干预后,不同程度下调上述促炎因子蛋白及mRNA水平,并降低上述蛋白表达,其中低剂量的丹参茎叶总酚酸+丹参酮组作用相对最优,表现出两者联用的协同增效作用。总之,丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用的抗炎活性至少部分是由于TLR4/PI3K/AKT/mTOR轴和STAT3蛋白的作用,从而缓解肠道炎症达到保护结肠炎的目的。(2)丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病小鼠模型的神经营养因子调节作用采用Western blot法测定小鼠海马中神经营养因子(BDNF和NGF)和其相应高亲和力受体(TrKB和TrKA)及NF-κBp65蛋白表达的变化。与正常对照组相比,模型组中小鼠海马中BDNF、NGF、TrKB、TrKA和NF-κBp65表达显著增加(P0.05)。给药干预后,仅丹参茎叶总酚酸+丹参酮组表现出一定的将NGF、TrKB和TrKA表达水平向正常对照组水平回调的作用,从而影响结肠炎小鼠海马中可能存在的某种异常反应(如神经发生增加)以间接改善结肠炎小鼠精神状态,显示出明显的协同增效作用。(3)丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用对炎症性肠病小鼠模型的代谢组学研究基于UPLC/Q-TOF/MS的血清及脑组织的非靶向代谢组学分析,以监测丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用干预后小鼠体内小分子代谢物水平的变化。PLS-DA分析结果显示,与正常对照组相比,模型组小鼠的血清及脑组织存在明显的代谢异常。丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用干预后,除个别组外均不同程度的缩短距离正常对照组的RD值,显示出一定的对血清及脑组织代谢紊乱的调节作用。其中低剂量的丹参茎叶总酚酸及丹参茎叶总酚酸+丹参酮组明显缩短RD值(P0.05),从整体代谢层面上显示出相对较优的调节作用。进一步对模型组中被显著扰乱的代谢物分析发现,共鉴定17个潜在的生物标志物(其中血清中10个,脑组织中7个)主要涉及氨基酸代谢(组氨酸代谢、色氨酸代谢和半胱氨酸和蛋氨酸代谢),花生四烯酸代谢和嘌呤代谢。丹参茎叶总酚酸与丹参酮联用干预后,对这些内源性生物标志物不同程度向正常对照组水平回调,从而有效改善结肠炎小鼠血清及脑组织的代谢紊乱。


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