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TRPV4参与急慢性瘙痒及升麻素止痒机制研究

严津津  
【摘要】:研究背景:瘙痒是一种令人不快的皮肤感觉,常伴发抓挠行为。从啮齿动物、鸟类到人类,广泛的物种都存在瘙痒感和抓挠行为。虽然急性瘙痒具有清除刺激性物质以避免进一步损伤的保护作用,但慢性瘙痒往往作为全身疾病伴随的症状,严重影响人们生活质量。它与许多疾病有关,包括特应性湿疹、银屑病、炎症性皮肤病、慢性肾功能衰竭、胆汁淤积症等。目前,慢性瘙痒仍然缺乏普遍有效的治疗方法,过去的二十年中,人们致力于在分子、细胞和动物水平上阐明瘙痒的机制。有越来越多的证据表明,瞬时受体电位(Transient Receptor Potential,TRP)通道在瘙痒信号传递中起着重要作用。在TRP家族中,除了已被广泛研究的与瘙痒密切相关的瞬时感受器香草酸受体1(Transient Receptor Potential Vaniloid 1,TRPV1)和瞬时感受器电位锚蛋白 1(Transient Receptor Potential Ankyrin 1,TRPA1),还存在其他的通道在急慢性瘙痒中起着不可或缺的作用,瞬时感受器香草酸受体4(Transient Receptor Potential Vaniloid 4,TRPV4)就是其中一员。有报道称TRPV4参与急慢性瘙痒,但对参与瘙痒的途径仍存在争议,如何参与痒觉传递亟需进一步探索。升麻素(cimifugin)为常用止痒中药防风的色原酮类成分,防风具有祛风解表、胜湿解痉等功效,可治外感表征、风疹瘙痒等病症。而升麻素作为其活性成分,也被报道有抑菌、抗病毒等作用。本课题主要通过检测到人类皮肤中TRPV4表达水平与银屑病的严重程度密切相关,建立小鼠急慢性瘙痒模型进一步探索TRPV4通道在痒觉发生中的作用,并观察升麻素对其介导的瘙痒模型的止痒效果,为临床提供有效的潜在止痒药物靶点和潜在止痒药物。研究目的:探究TRPV4如何参与急慢性瘙痒及升麻素止痒作用机制研究。研究方法:1.临床银屑病患者瘙痒皮肤病理切片经HE染色后,观察表皮增生的情况,免疫荧光染色实验检测TRPV4的表达情况。2.行为学实验:(1)在WT小鼠和TRPV4-/-小鼠颈背部皮内注射致痒源,探究TRPV4参与瘙痒的途径及升麻素的止痒作用。(2)在小鼠剃毛的背部皮肤上局部施用5%咪喹莫特乳膏,连续5天,诱导银屑病模型,探究TRPV4在慢性瘙痒中的作用及升麻素对银屑病瘙痒的治疗作用。3.机制研究:使用实时定量PCR技术、免疫荧光染色实验及Western Blot实验,检测TRPV4在小鼠银屑病造模区皮肤和DGR中的表达情况。5.细胞实验:(1)利用传代培养的人角质形成(HaCaT)细胞,通过钙成像技术研究升麻素对人角质形成细胞中TRPV4离子通道活性的作用。(2)利用WT小鼠急性培养的DRG神经元,通过钙成像技术研究升麻素对小鼠DRG中TRPV4离子通道活性的作用。(3)在HEK293细胞中转染TRPV4的质粒,通过钙成像技术研究升麻素对TRPV4离子通道是否直接作用。(4)在HEK293细胞中转染TRPV4的质粒,通过全细胞膜片钳技术研究升麻素对TRPV4离子通道活性的作用。研究结果:(1)银屑病患者瘙痒皮肤组织病理学观察显示皮肤屏障功能障碍和角质形成细胞增殖的特征,人类皮肤中TRPV4的表达水平与银屑病的严重程度密切相关。(2)TRPV4是痒觉发生所必需的,它参与五羟色胺依赖的瘙痒,也参与组胺依赖的瘙痒,但与氯喹介导的瘙痒无关。(3)TRPV4与小鼠银屑病慢性模型中的瘙痒行为的发生密切相关,TRPV4-/-小鼠银屑病造模后,抓挠行为显著减少。(4)小鼠银屑病慢性模型中,造模区所对应的皮肤和DRG中TRPV4表达增加。(5)升麻素能抑制TRPV4介导的急性瘙痒行为,但不能抑制五羟色胺或组胺介导的急性瘙痒行为。(6)升麻素能缓解小鼠银屑病慢性模型中的瘙痒行为,也能抑制银屑病引起的TRPV4的表达增加。(7)升麻素能抑制人角质形成细胞以及小鼠DRG神经元中TRPV4的功能;升麻素能抑制转染TRPV4质粒的HEK293细胞中GSK101引起的钙离子内流和内向电流;其对TRPV4的抑制作用是直接的。研究结论:1.人类皮肤中TRPV4的表达水平与银屑病的严重程度密切相关。2.TRPV4参与小鼠急慢性瘙痒。3.升麻素抑制TRPV4介导的小鼠急性瘙痒。4.升麻素可以抑制小鼠银屑病慢性模型诱导的瘙痒行为并抑制银屑病慢性模型引起的TRPV4的表达升高。5.升麻素对可以抑制HaCaT细胞及小鼠DRG中TRPV4的活性并直接抑制HEK293T转染细胞的TRPV4活性。


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