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蛇床子素调节Akt/ZO-3信号通路修复皮肤屏障机制研究

胡雪勤  
【摘要】:特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种常见的炎症性皮肤病,伴随严重的慢性瘙痒并显著降低患者的生活质量。临床调查结果显示:多数患者对现有药物的治疗效果并不满意。多种中药对皮肤瘙痒症表现出显著的治疗效果,其中蛇床子为最常用的抗炎止痒中药之一,而蛇床子素为蛇床子的主要有效成分。大量研究表明皮肤屏障的破坏为特应性皮炎的重要发病因素,但屏障破坏的机制目前尚不完全清楚。结合现有的研究报道,我们有理由推测:蛇床子素通过修复皮肤屏障发挥消炎止痒的作用。目的:探究特应性皮炎皮肤屏障破坏机制,评价蛇床子主要成分蛇床子素对特应性皮炎的治疗效果并探究其治疗机理。实验方法:1.建立恶唑酮诱导的特应性皮炎小鼠慢性模型:恶唑酮小鼠腹部致敏5天后(第5天),每48小时于小鼠颈部给予恶唑酮刺激一次,共四次,小鼠分为对照组和模型组。在第6、8、10、12天(刺激后24小时)记录小鼠的抓挠次数,在第12天将小鼠处死,对小鼠皮肤进行取材。提取小鼠皮肤RNA进行qRT-PCR,检测紧密连接相关基因mRNA表达变化。2.设计SiRNA转染干扰人角质形成细胞ZO-3表达,CCK8试剂盒检测细胞数。SiRNA干扰人角质形成细胞(HaCaT)ZO-3表达。qRT-PCR、Western blot检测SiRNA转染后细胞ZO-3基因及蛋白表达水平。测量转染后人角质形成细胞跨膜电阻。3.建立慢性特应性皮炎小鼠模型(方法同上),小鼠分为对照组和模型组(n=6),第12天小鼠处死后取造模区域皮肤提取皮肤总蛋白检测p-Akt、p-Erk表达水平。4.p-Akt激动剂SC79诱导人角质形成细胞p-Akt上调,Western blot检测ZO-3表达水平。5.建立恶唑酮诱导的小鼠特应性皮炎慢性模型(方法同上),小鼠分为模型组、p-Akt抑制剂治疗组(腹腔注射,72小时一次),在第12天用高清相机记录小鼠抓挠次数后将小鼠处死,对小鼠皮肤进行取材,提取小鼠皮肤总蛋白,Western blot检测ZO-3以及p-Akt表达变化,小鼠皮肤样本后固定进行冰冻切片及免疫荧光染色。6.建立恶唑酮诱导的特应性皮炎小鼠耳肿胀模型,模型小鼠右耳给予高剂量(0.9mg/只)、低剂量(0.3mg/只)蛇床子素治疗(外用),左耳给予溶剂治疗。于治疗后每小时测量一次小鼠双侧耳厚度,连续6小时。7.建立特应性皮炎动物模型(方法同上)。动物分为模型组、高剂量蛇床子素治疗组和低剂量蛇床子素治疗组。蛇床子素治疗从第5天起每天2次(外用,溶剂:80%丙酮+20%橄榄油50μL),高剂量蛇床子素0.9mg/只,低剂量蛇床子素0.3mg/只。模型组用溶剂治疗,第5天起每天2次(外用,溶剂:80%丙酮+20%橄榄油50μL)。第12天用高清相机记录小鼠抓挠行为后将小鼠处死,对小鼠造模区域皮肤进行取材,qRT-PCR法检测小鼠造模区域皮肤mRNA表达变化。8.蛋白印迹法及免疫荧光染色对小鼠造模区域皮肤蛋白表达进行检测。9.①人角质形成细胞分为对照组,低、中、高剂量蛇床子素治疗组,细胞接种于96孔板,待细胞贴壁后加入蛇床子素(终浓度10、20、40 mM),对照组加入相同浓度溶剂,48h后CCK8试剂盒检测细胞数。②人角质形成细胞分为对照组,激动剂组,低、中、高剂量蛇床子素治疗组,细胞接种于12孔板,待细胞贴壁后加入蛇床子素(终浓度10、20、40μM,0.1%DMSO),对照组和激动剂组加入相同浓度溶剂,12h后激动剂组及低、中、高剂量蛇床子素治疗组加入SC79(终浓度20μM,0.1%DMSO),对照组加入相同浓度溶剂,48h后提取细胞总蛋白,检测p-Akt和ZO-3的表达变化。实验结果:1.恶唑酮模型导致明显的皮肤损伤以及紧密连接蛋白基因表达变化。第12天对小鼠皮肤进行皮损评分,模型组小鼠的皮肤损伤程度显著高于对照组。第6-12天记录的小鼠抓挠行为显示恶唑酮诱导的特应性皮炎模型小鼠伴随着严重的瘙痒。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,模型组小鼠皮肤中紧密链接蛋白基因Cldn-1、Cldn-6、Cldn-8、Cldn-9、Cldn-23、ZO-3、Ocln mRNA 表达水平显著下调,Cldn-3、5、7、15、JAM-2显著上调。免疫荧光结果显示:ZO-3蛋白主要位于表皮细胞的细胞膜上,与对照组相比模型组小鼠皮肤中ZO-3蛋白表达水平变化与mRNA表达水平变化一致,均明显下调。2.ZO-3在人角质形成细胞紧密连接的形成中扮演重要角色。ZO-3 SiRNA可有效降低ZO-3 mRNA及蛋白表达水平,ZO-3表达水平下降可使人角质形成细胞跨膜电阻显著下降。3.特应性皮炎模型小鼠皮肤中p-Akt表达上调。与对照组相比模型组小鼠皮肤中的p-Akt表达上升,而p-Erk蛋白表达无明显变化。4.人角质形成细胞中ZO-3的表达受PI3K-Akt信号通路调节。SC79(p-Akt激动剂)可有效诱导人角质形成细胞中p-Akt表达上调,及ZO-3表达下调。5.PI3K-Akt信号通路参与调节特应性皮炎模型小鼠皮肤中ZO-3的表达及皮肤瘙痒。LY294002可有效抑制特应性皮炎模型小鼠皮肤中p-Akt表达上调,抑制剂治疗可显著减少小鼠的抓挠行为,抑制剂治疗组小鼠皮肤ZO-3荧光信号显著高于模型组。6.蛇床子素可有效缓解恶唑酮诱导的小鼠耳肿胀。恶唑酮诱导的小鼠耳肿胀在蛇床子素治疗后第2、3、4、5、6h被有效缓解,给与高剂量治疗的小鼠治疗侧耳厚度均显著低于未治疗侧耳厚度,在治疗后第3h,给与低剂量治疗的小鼠治疗侧耳厚度显著低于未治疗侧耳厚度。7.蛇床子素可保护皮肤屏障有效缓解特应性皮炎的瘙痒症状。蛇床子素治疗可显著降低小鼠皮损评分且呈浓度依赖。第8、10、12天,高剂量蛇床子素治疗组小鼠的抓挠次数均显著低于模型组,第10天低剂量蛇床子素治疗组小鼠的抓挠次数显著低于模型组。与模型组相比,高剂量蛇床子素治疗组小鼠皮肤中Cldn6、Cldn8、ZO-1、ZO-2、ZO-3、JAM-1、JAM-3、MUPP-1 的 mRNA 表达显著上调,低剂量蛇床子素治疗组的小鼠皮肤中Cldn8、ZO-1、JAM-3的mRNA表达显著上调。8.蛇床子素治疗可调节Akt/ZO-3通路。蛇床子素治疗可使模型小鼠皮肤中的p-Akt蛋白表达水平显著下调且呈浓度依赖。免疫荧光结果显示高剂量蛇床子素治疗组小鼠皮肤中的ZO-3蛋白荧光信号显著强于模型组。9.在人角质形成细胞上蛇床子素通过Akt信号通路调节ZO-3蛋白表达。10μM蛇床子素作用于人角质形成细胞48h不影响细胞增殖,20和40μM蛇床子素可抑制人角质形成细胞增殖。激动剂组的p-Akt表达水平显著高于对照组,10、20、40μM的蛇床子素均可显著抑制SC79诱导的p-Akt表达上调,激动剂组的ZO-3表达水平显著低于对照组,10μM蛇床子素孵育同时抑制人角质形成细胞ZO-3表达下调。结论:①ZO-3表达下调为特应性皮炎发病的重要机制之一。②恶唑酮诱导的特应性皮炎模型中,ZO-3的表达下调受Akt信号通路调控。③蛇床子素可通过抑制Akt信号通路上调ZO-3的表达,抑制特应性皮炎中的皮肤屏障破坏及慢性瘙痒。


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