LC-MS技术在不同炮制程度甘草、白芍质量标志物的发现及肠道菌对人参皂苷代谢转化研究中的应用

【摘要】：液质联用(LC-MS)技术越来越多地被应用于药物分析发现和开发的不同阶段中,包括药物发现、产物表征、代谢研究(体外和体内)以及杂质和代谢产物的鉴定等。本论文将液质联用技术应用于不同炮制程度的甘草、白芍质量标志物的发现以及肠道菌群对人参皂苷的体外转化研究中。本文第一、二部分阐述了将代谢组学方法应用于寻找不同炮制程度中药饮片蜜炙甘草、酒白芍的次生代谢化合物的差异标志物中。采用超高效液相色谱与四极杆串联飞行时间质谱仪联用技术(UPLC-Q-TOF/MS)以及超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用技术(UPLC-TQ-MS/MS),结合多元统计分析方法,以甘草、白芍生药以及不同炮制程度的蜜炙甘草、酒白芍为实验材料,对其次生代谢产物进行化学成分差异性分析,筛查具有差异性的特征化合物。通过建立的UNIFI理论数据库结合对照品的实物库鉴定了中药甘草生药中57个化学成分,其中正离子采集模式鉴定了 37个成分,负离子采集模式鉴定了 56个成分;白芍生药中11个化学成分,其中正离子采集模式鉴定了 7个成分,负离子采集模式鉴定了 10个成分。主成分分析(PCA)结果表明,甘草、白芍饮片中次生代谢化合物随炮制程度的不同其差异均较为明显。采用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)方法筛查了炮制适度组和生药组之间的差异化合物,偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)方法筛查炮制不及、炮制适度和炮制太过组之间的差异化合物,均发现甘草中甘草皂苷E2、甘草皂苷G2和甘草酸含量存在差异;白芍中芍药苷和苯甲酰芍药苷含量存在差异。另外,通过对数据矩阵的分析,发现没食子酸乙酯仅存在于酒白芍中。最后,利用UPLC-TQ-MS/MS以及对照品分别对甘草和白芍中的相应化合物进行定量确证,发现甘草酸和芍药苷在炮制适度时含量最高,炮制太过后含量下降,可能可以分别作为不同炮制程度甘草和白芍饮片的差异化合物,指导中药饮片蜜炙甘草、酒白芍的炮制程度的过程控制;另外,没食子酸乙酯是白芍经酒炙后产生的化合物,且随着炮制时间的增加其含量相对增加,可作为白芍炮制前后的化学标志物。本部分为研究蜜炙甘草和酒白芍饮片炮制程度的质控评价提供了数据支持,并为炮制工艺优化提供了科学依据。本文第三部分阐述了利用UPLC-Q-TOF/MS技术研究原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc在人肠道菌群中的代谢转化的异同。从人肠道菌群孵育液中总共鉴定出15个代谢物,其中13个为去糖基代谢物,2个是氧化代谢物。这些代谢物分别是人参皂苷 Rd、Rg3、F2、Compound K、PPD、Compound O、Compound Y、Compound Mx、Compound Mc-1、Compound Mc、绞股蓝皂苷 XVII、LXXV、IX 以及Compound K氧化物和PPD氧化物。根据原形化合物经肠道菌群代谢产生的去糖基代谢物的生成速率,以及结合前人研究,提出了 PPD型人参皂苷的代谢途径:Rb1/Rb2/Rb3/Rc→Rd→F2→Compound K→PPD,主要是选择性消除糖基的水解反应;另外,人参皂苷Rd是原形化合物脱C-20位外侧糖产生的代谢物。通过监测原形化合物及其代谢物的峰面积,发现在四个原形化合物孵育液中Rd生成得最快;同时,在Rb1孵育液中,Rb1的含量下降得最快,并且Rd生成得也最快,提示肠道菌群水解与C-20位末端糖苷键的速率较快,其中末端葡萄糖糖苷键被水解得最快,推测C-20位末端糖苷键具有较高的酶催化效率,且其末端葡萄糖糖苷键的酶催化效率最高,说明C-20位末端取代基的不同会影响PPD型人参皂苷在肠道菌群中的稳定性。本部分为基于肠道菌群探索PPD型人参皂苷药效物质基础的确定以及其类似物是否以相似的方式影响肠道菌群提供了科学依据。