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基于多组学的盐胁迫下金银花的品质形成机制研究

蔡芷辰  
【摘要】:金银花系忍冬科植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花,是一种常用的具有清热解毒、疏散风热功效的大宗类中药材,亦有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、增强免疫、保肝利胆、降血糖等多种药理作用,可用于痈肿疔疮、风热感冒、喉痹、丹毒、温病发热和热毒血痢等病症的治疗。同时,近年来的临床实践也表明金银花具有对SARS、H1N1流感病毒和COVID-19的预防作用。市场需求大,但其品质参差不齐,且近源品种较多,存在混伪、掺假等现象。随着世界土壤盐渍化面积的增加,植物的耐盐性研究已广泛引起国内外研究学者的重视。金银花的主产区,山东、河南等地,土壤盐渍化面积大且分布广泛,盐胁迫环境与其药材的品质密切相关,适度的盐胁迫可促进其有效成分的合成与积累,从而提高药材质量。然而,在金银花品质形成过程中,盐胁迫如何影响其指标成分的合成与积累以及盐胁迫下金银花药材品质形成的分子机制至今尚不清楚,因此,对金银花进行品质评价及盐胁迫下品质形成机制的研究,是控制其内在质量、促进品质提升的重要环节。主要研究内容如下:1.多元指标成分分析优化建立了基于UFLC-QTRAP MS/MS技术同时测定金银花、忍冬藤和山银花中多元指标成分含量的方法,并结合多元统计分析对不同产地、不同批次的各药材的质量进行综合评价。结果表明,不同样品中有机酸、黄酮、环烯醚萜、皂苷、氨基酸和核苷6类成分的含量存在显著差异;花蕾中有机酸、黄酮、以及环烯醚萜类化合物的含量均高于开放的花。主成分分析(PCR)结果显示金银花可分别与山银花、忍冬藤分开;通过最小二乘法判别分析(PLS-DA)进一步筛选出11个金银花与山银花的化学差异标志物:脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、绿原酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、原儿茶酸、断氧化马钱子苷、断马钱子酸、莫诺苷、灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙;9个金银花与忍冬藤的化学差异标志物:异绿原酸A、绿原酸、新绿原酸、奎尼酸、木犀草苷、马钱苷、断马钱子酸、断氧化马钱子苷、莫诺苷、异亮氨酸。灰色关联度分析(GRA)结果表明,金银花的质量优于山银花,金银花花蕾的质量优于开放的花。该研究可为金银花的内在质量控制提供新的方法参考。2.忍冬地上部分的化学成分差异性分析通过优化建立UFLC-Triple TOF-MS/MS技术结合多元统计分析的方法,分析忍冬地上部分(叶、花蕾、花和茎枝)化学成分的差异。共鉴定得到71个化合物(4个生物碱、24个有机酸、23个黄酮、15个环烯醚萜和5个皂苷类)。PCA结果显示,叶与花蕾混在一起,花蕾与花之间也存在重叠,只有茎枝与其他部分完全分开。进一步应用PLS-DA分析进行区分,并基于VIP值,筛选出异绿原酸B、异绿原酸C、山柰酚-3-O-芦丁苷、木犀草苷、紫云英苷、马钱苷、忍冬苷和断马钱子酸可视为地上部分的化学差异标志物。该研究方法为后续盐胁迫下金银花的代谢组学分析提供参考。3.盐胁迫对金银花生理及多元指标成分的影响通过建立忍冬植物生长盐胁迫模型,对其进行4个不同水平的盐胁迫处理;从形态、生理生化指标(包括:叶绿素a和b、总叶绿素、类胡萝卜素、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛、总氨基酸含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶)及指标成分含量不同层面进行金银花的质量评价。结果表明,低盐胁迫金银花的生长参数、生理生化指标优于其他组;且低盐组金银花中47个指标成分的总含量也较高,为对照组的1.1倍;聚类分析结果显示对照组与盐胁迫组金银花分界明显,说明盐胁迫对金银花指标成分的含量影响较大;PLS-DA分析显示4组样品可明显分开,其中化合物谷氨酸、赖氨酸、新绿原酸、獐芽菜苷、马钱苷酸、断马钱子酸和断氧化马钱子苷对样品的分离贡献值较大;不同盐胁迫下金银花的GRA分析结果表明,低盐胁迫可促进金银花品质的改善,高盐则相反。Pearson相关系数分析结果表明,酚酸积累的增加可减少植物的氧化损伤。4.盐胁迫下金银花的多组学研究(1)非靶向代谢组学分析采用UFLC-Triple TOF-MS/MS技术结合多元统计分析,对4个不同水平盐胁迫35天的金银花进行非靶向代谢组学分析。共鉴定90个代谢物。正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析可明显区分各组样品,并筛选出47个差异代谢物,低盐组样品中各差异成分的相对含量(峰面积)高于中盐和高盐组。金银花中的苯丙素生物合成途径、单萜类生物合成途径、糖酵解、TCA循环和生物碱生物合成途径均受到盐胁迫的干扰。结果表明,盐胁迫显著诱导了金银花的代谢过程,低盐组差异成分的相对含量较高。该研究为金银花的盐胁迫响应和品质评价提供参考,也为后续进行蛋白质组和转录组分析奠定基础。(2)蛋白质组学分析采用TMT技术结合生物信息学,对金银花低盐胁迫组与对照组进行比较蛋白质组学分析。根据蛋白质组学分析,绘制盐胁迫下金银花中蛋白变化的分子图谱,并筛选出酚酸、黄酮及环烯醚萜类活性成分合成途径中的关键差异表达蛋白(DEPs)。KEGG通路富集分析中苯丙素类和单萜类生物合成被显著富集,活性成分合成途径中的 DEPs(PAL、4CL、C4H、HCT、C3H、COMT、CHI、F3H、SLS、DXS 和 G10H)在低盐组的表达均上调。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络表明,盐胁迫期间忍冬植物的代谢活性旺盛,DEPs主要参与了能量代谢和碳水化合物代谢;并采用平行反应监测(PRM)验证候选蛋白的丰度。(3)转录组学分析采用RNA-Seq技术结合生物信息学,对低盐胁迫组与对照组的金银花进行转录组学分析。根据转录组学数据,共获得了 78,261个基因序列,其中1,055个参与次生代谢产物生物合成的差异表达基因(DEGs),筛选出盐胁迫下金银花中参与活性成分合成 DEGs(PAL、HCT、4CL、C3'H、CHS、FLS、F5H、CAD、COMT 和 CCR),除FLS和F5H外,其他DEGs在低盐组的表达均上调;并采用qRT-PCR验证相关DEGs。系统进化树分析和选定的PAL差异基因的多重核苷酸序列比对结果显示,PAL基因(TRINITY_DN16988_c0_g14)与拟南芥成簇,与 ATPAL1 和 ATPAL2 的同源性为 73.96%。因此推测盐胁迫下金银花中PAL基因的表达上调可促进酚类成分的积累,在抗盐胁迫中起重要作用。此外,盐胁迫金银花中分别注释得到261和122个CYP450和UDP-糖基转移酶基因;MYB、AP2/ERF、C2C2、bHLH和NAC等转录因子也参与了金银花的盐胁迫响应,其中,MYB(210)家族在盐胁迫金银花中最丰富。5.盐胁迫下金银花的多组学联合分析结合金银花盐胁迫前后的代谢谱、代谢物的含量、活性成分合成途径中关键差异表达基因和蛋白,联合绘制金银花中酚酸、黄酮及环烯醚萜类成分生物合成网络。(1)金银花的比较蛋白质组与活性成分含量的关联分析将金银花的比较蛋白质组与活性成分的含量关联分析,联合绘制金银花中酚酸、黄酮、环烯醚萜类成分生物合成网络,发现盐胁迫下金银花中相关结构蛋白的表达与活性成分含量的变化趋势基本一致。(2)金银花的转录组和非靶向代谢组的关联分析将金银花的转录组与非靶向代谢组结果关联分析,联合绘制酚酸、黄酮类成分生物合成网络,发现差异基因的表达与酚酸、黄酮类成分的相对含量及绿原酸和木犀草苷的含量变化呈正相关。此外,72%的糖基转移酶基因也在盐胁迫组显著上调,因此推测其与下游黄酮糖苷类成分的合成和积累密切相关。(3)金银花的蛋白质组和转录组的关联分析将盐胁迫下金银花的蛋白质组和转录组联合分析,筛选得到共有差异蛋白/基因及糖基转移酶。综上,本研究在对金银花、山银花和忍冬藤药材的品质进行综合评价的前提下,从形态、生理、指标成分含量、代谢组学、蛋白质组学及转录组学的层面,对盐胁迫下金银花的品质及活性成分合成与积累的机制进行综合分析,阐释了金银花中活性成分合成与关键差异基因和蛋白之间的逻辑关系,以揭示盐胁迫下金银花品质形成的分子机制。


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