血小板细胞膜固相色谱法的建立及其在治疗血栓性疾病中药分析中的应用

【摘要】：生物色谱法(Biochromatography)是生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。它利用药物产生效应(或产生毒性作用)一般是通过药物与靶点(受体、通道、酶等)结合的原理，采用生物靶点选择性地固化效应物质，从而分析、分离效应物质，是一种效应—化学分析—成分分离联动的技术，可应用于药物活性成分的筛选、药物作用机理的研究。 血小板在血栓性疾病中有重要地位，其膜上有诸多的受体及其他药物作用靶点。许多中药能够治疗血栓性疾病，但是中药是由多种化合物组成的复合体系，效应机理多数不明确，应用单一靶点的的生物色谱技术难以阐明其疗效—效应成分的关系。如果中药的提取物具有治疗血栓性疾病的作用，那么其中的活性物质应该能够与血小板上的受体或其他靶点结合。基于此建立了一种方法，即中药与血小板孵育后，将未结合的物质洗去，再将与血小板结合的效应物质从其结合的受体或靶点上解离下来，这些效应物质可用色谱方法(比如高效液相色谱)进行分析，我们将这种生物色谱方法称为血小板固相色谱法(PMIC)。 本文采用血小板活性细胞膜为固定相，固相化中药的效应成分，细胞膜的完整性、膜受体的立体结构、周围环境和酶活性得以保持，能够特异、选择性地与作用于血小板的活性成分结合，排除其他成分的干扰，适合于以血小板为作用靶点的中药的效应成分研究。 文章的第一部分研究了丹参水提液的血小板细胞膜固相色谱。丹参具有活血化瘀、凉血消肿、清心除烦之功效。现代药理学表明丹参具有增加冠脉血流量、降血脂、抑制血栓形成、抗血栓和改善微循环等作用。丹参中化学成分主要分为两类：脂溶性二萜醌类和水溶性酚酸类。本文首先用线性梯度流动相对丹参水提液的指纹图谱进行了研究，研究表明最佳检测波长为278nm，最佳记录时间为70min。在此条件下，得到丹参的HPLC指纹图谱，作为血小板细胞膜固相色谱法研究的基础。 血小板膜上的效应靶点与丹参水提液中的活性成分特异地结合，然后用磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗掉未被血小板细胞膜特异性结合的成分，最后用pH4的磷酸盐溶液使靶点失活，使与血小板膜受体特异性结合的成分解离下来，将该保留 液按指纹图谱的色谱条件进行色谱分析，以解离液的色谱作为指针，从月一参水提 液中得到六个与血小板特异结合的成分。丹参水提液分别用石油醚、氯仿、乙酸 乙醋和正丁醇萃取，得到氯仿、乙酸乙酷、正丁醇部位及剩余水提部位，将丹参 血小板解离液与几个部位的HPLC图谱对比可见，解离液中的活性成分基本都在 乙酸乙酷部位，活性成分的分离可从乙酸乙酷部位得到。 文章的第二部分我们研究了脉络宁注射液的血小板细胞膜固相色谱，首先建 立了脉络宁注射液的指纹图谱，选择了各批样品共有的、保留时间以及峰面积相 对稳定的12个色谱峰作为脉络宁注射液指纹图谱的共有峰。与血.小板特异结含 的成分有8个，均为脉络宁组方中K组分的成分。但结合程度有明显差别，其中 2、5、6、7、8号峰的成分在血.小板固相色谱中百分含量明显高于指纹一谱。采用 制备HPLC进一步制备这8个一单体化合物，经标准品对照、质谱及核磁共振鉴定 己经明确的是绿原酸、咖啡酸，其余推测为绿原酸的同分异构体和异绿原酸类化 合物。 对脉络宁注射液的血.小板细胞膜固相色谱法筛选得到的特异结合的成分进 行了效应验证。首先，我们研究了体外抗ADP诱导的血小板聚集作用，发现脉 络宁中单味药K组分的作用最强，其ICS。值为o.028mg/ml。利用血小板固相色 潜法筛选出的脉络宁注射液的活性成分均具有不同程度的抗ADP诱导的血小板 聚集作用，就ICS(，而言，1、4、7、8号峰的样品半数效应量值较低，说明其活性 较强。由于病理状态下内皮细胞具有促进血栓形成的作用:内皮细胞功能紊乱， 抗血栓作用减弱，是血栓形成的关键环节，并且，内皮细胞表面存在Fll受体， 该受体是一种细胞勃附分子，同样存在于血小板细胞膜_匕它在血.小板聚集、因 子分泌、勃附及内皮细胞炎症等方面扮演着重要角色。该受体对调控止L小板的聚 集、因子分泌等起到决定性的作用。因而我们又对筛选出的活性成分进行了抗人 脐静脉内皮细胞氧化损伤的作用，4、5、6、7、8五样品具有直接对抗作用。由 此说明血小板细胞膜固相色谱模型基本可以反映化合物与细胞膜及膜蛋白(包括 受体)的相互作用;活性成分在该体系中的保留特性和其药理作用有显著的相关 性。 文章的第三部分我们利用血小板细胞膜固相色谱法初步探讨了脉络宁注射 液的血浆蛋白结合率，对多组分中药进行了血浆蛋白结合率的研究。对复杂成分， 特别是存在未知成分的中药注射液中的效应成分与血浆蛋白结合的研究，现行的 方法几乎不能或很难进行，本文提供了一种可以探索的方法。当然，这只是一次 探索，还有许多需要完善之处。