系统性红斑狼疮OAZ基因通路的研究

【摘要】： 目的：探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者OAZ通路相关基因的功能。 方法：实验一：收集SLE患者和正常对照骨髓前体细胞(各5例),提取RNA,逆转录为cDNA,加入相应的引物、SYBR Green I在ABI Prism 7500型高通量荧光定量仪上进行实时荧光定量PCR,采用看家基因酸性核糖体磷蛋白大亚基(RPLPO)进行标化,观察OAZ、Id3、BMP4、BMP6、Smad6、EHZF、LY6E基因的表达量与SLE疾病活动相关指标关系。同时收集30例SLE患者和20例正常人外周血细胞,对上述结果进行验证。 实验二：采集并分离SLE患者外周血单个核细胞,分为实验组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组进行细胞培养。实验组和阳性对照组分别用OAZ和GAPDH小干扰RNA(siRNA)在体外对培养细胞进行干扰,阴性对照组采用无关RNA序列,空白对照组为培养基对照。72小时后分离细胞和上清液,从细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,用实时荧光定量PCR分析不同分组OAZ信号通路相关基因OAZ、Id1、Id2、Id3、Id4mRNA表达水平的变化。ELISA法测定上清液中IFN-γ、IL4、IL10、IL12、IL21、CCL2、ANA浓度,并分析这些因子分泌水平与OAZ基因表达的相关性。 实验三：从骨髓或脐带血中分离培养间充质干细胞(MSC)移植治疗10例SLE患者,采集并分离移植前、移植后1周、4周患者外周血有核细胞,从细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,用实时荧光定量PCR技术分析不同分组OAZ信号通路相关基因OAZ、Id1、Id2、Id3 mRNA表达水平的变化。ELISA法测定移植前后患者血清中IL10、IL12、IL21、CCL2、ANA浓度,并分析这些因子分泌水平与OAZ基因表达的相关性。 结果：实验一：SLE患者骨髓前体细胞OAZ、Id3基因的mRNA表达水平(△Ct分别为10.6±0.5、5.8±3.2)较正常对照组(△Ct分别为16.5±0.9、10.4±2.6)显著增高,且表达水平高于外周血细胞；BMP6、BMP4基因表达水平虽较正常对照有高表达趋势,但差异无统计意义。SLE患者外周血细胞OAZ、Id3、BMP4、BMP6mRNA基因表达(△Ct分别为14.1±2.7、7.5±1.8、7.6±3.3、5.2±2.2)均显著高于正常(△Ct分别为16.1±2.2、9.5±1.7、9.7±0.3、6.4±1.2)。骨髓前体细胞OAZ、BMP6、BMP4、Id3的表达水平ACt值与SLEDAI积分、肾脏损伤指数、抗双链DNA (dsDNA)抗体、RNA相关抗体水平呈负相关；与补体C3呈正相关。 实验二：实验组OAZ、Id1、Id2、Id3基因的mRNA表达水平(△Ct分别为12.5±1.4、8.9±1.5、4.3±0.8、8.0±1.1)较阴性对照组(△Ct分别为10.2±1.1、6.5±1.2、2.4±1.3、6.2±1.2)显著降低(P0.05)；Id4表达水平虽较阴性对照组有低表达趋势,但差异无统计学意义。实验组IFN-γ、IL10、IL12、IL21、ANA的水平明显低于阴性对照组；而CCL2高于阴性对照组(P0.05)。实验组与阴性对照组OAZ mRNA表达水平△△Ct值与ANA的OD比值、IL21浓度比值呈负相关；与Th1/Th2、CCL2比值呈正相关。 实验三：移植后1周、4周OAZ、Id1、Id3基因的mRNA表达水平[ACt(1周)分别为12.4±1.1、9.7±1.9、9.7±1.9、2.1±1.0；△Ct(4周)分别为13.3±1.2、10.4±1.5、10.8±1.2、2.1±1.2]较移植前(△Ct分别为11.0±0.9、7.4±2.1、7.8±2.1、0.1±1.5)均显著降低(P0.05)；Id2表达水平虽较移植前有低表达趋势,但差异无统计学意义。移植4周后IL10、IL21、ANA的水平明显低于移植前,IL12／IL10、CCL2高于移植前(P0.05),但移植后1周的水平较移植前没有差异。移植前与移植后4周OAZ mRNA表达水平变化与ANA的OD值和IL21浓度比值呈负相关；与IL12/IL10、CCL2比值呈正相关。 结论：一：OAZ通路相关基因在SLE中异常表达,与疾病发生相关。 二：OAZ基因沉默可有效降低狼疮外周血单个核细胞中OAZ信号通路相关基因表达,同时减低多种细胞因子及抗核抗体水平,推测OAZ可能通过Id基因影响细胞因子的水平并导致ANA异常表达。 三：同种异体MSC移植治疗SLE可降低患者外周血中OAZ信号通路相关基因表达,同时减低多种细胞因子及抗核抗体水平,推测OAZ信号通路是MSC移植治疗SLE有效机制之一。