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条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析

庞书英  
【摘要】:本论文共分为4个部分: 1.综述近年来B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的研究进展。 2.探讨鱼类BAFF基因研究的意义。 3.通过RT-PCR和RACE技术,从条纹斑竹鲨鱼(Chiloscyllium plagiosum)脾脏组织中扩增得到B淋巴细胞刺激因子(CpBAFF)的全长cDNA序列。CpBAFF由272个氨基酸组成,与其它脊椎动物BAFF相同,CpBAFF氨基酸序列中也含有一个跨膜区和一个弗林酶切位点。CpBAFF与其它已知的硬骨鱼类斑马鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚、三刺鱼、彩虹胡瓜鱼和虹鳟鱼在氨基酸水平上的相似性分别为36%,40%,43%,45%,47%和57%。Real time PCR实验表明BAFF主要存在于条纹斑竹鲨的免疫器官脾脏和肾脏中。在大肠杆菌BL21 (DE3)中高效表达了带有His6标签的重组可溶性CpsBAFF,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。目的蛋白CpsBAFF经Ni 2+-IMAC纯化后,在体外可刺激B细胞存活,并呈剂量依赖性。CpBAFF是从软骨鱼中获得的第一个BAFF分子,而且是目前克隆到的最原始的BAFF基因,这对研究脊椎动物免疫因子的进化有着重要意义。 4.通过RT-PCR和RACE技术,从鲫鱼(Carassius auratus)脾脏组织中扩增得到B淋巴细胞刺激因子的全长cDNA序列(CaBAFF)。CaBAFF cDNA全长1639 bp,包括408 bp的5端非编码区、438 bp的3端非编码区和795 bp的开放读码框(编码242个氨基酸)。与已知其它BAFF一样,其氨基酸序列中也含有一个跨膜区和TNF结构域。Blast分析表明,CaBAFF与斑马鱼、彩虹胡瓜鱼、大西洋鲑鱼、虹鳟鱼和斑点绿河豚分别有77%、66%、59%、59%和47%的氨基酸序列同源性。同时利用分子生物学软件分析了鲫鱼CaBAFF蛋白质的基本性质。本实验为继续研究BAFF基因在鲫鱼中的生物学功能及与免疫的关系奠定了基础。


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