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4种转基因玉米液相芯片检测方法的建立

程涛  
【摘要】:近年来,随着生物技术的发展,转基因作物的种植面积大幅度增加,其安全性受到公众的广泛关注。一些国家要求检测是否含有转基因成分,有的还需要确定属于哪个转基因品系。转基因玉米是世界第二大种植作物,目前我国许可进口的转基因玉米品系有12种,主要用于加工原料,是转基因玉米中的代表品系。因此,加强对转基因作物及其产品的检测显得非常重要。目前,针对转基因作物的检测主要是以PCR为基础的核酸检测和蛋白质检测,近年来广泛使用的主要是基因芯片和实时荧光定量(Real-time PCR)检测,但由于转基因作物种类多、数量大,且一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后,转基因成分部分或者全部降解,从而使得检测难度加大。因此,建立更加先进、快速、高通量的检测方法已迫在眉急。液相芯片是近几年发展起来的一种新型的高通量检测技术平台,该方法具有准确性高、耗时短、操作简便、高通量检测的优点,适合对多种转基因作物进行快速检测。 本研究选取常见的4种转基因玉米,Bt176、Bt11、NK603和MON810为研究对象,通过查阅NCBI数据库,找出4种转基因玉米外源基因与玉米基因组的连接序列,同时以玉米特异性Zein内源基因序列作为参照,应用DNA star、Primer5.0、DNA MAN和Primer Express3.0等分子生物学软件分析、设计并筛选了5对特异性引物和5条特异性探针。经合成后,用特异性引物扩增目的基因序列,同时将探针与荧光编码微球偶联,之后将偶联微球的探针与扩增的目的PCR产物杂交,最终用液相芯片检测仪(Bio-plex200)检测荧光信号。并分别构建了针对5种目的基因的克隆质粒DNA,通过测序进行鉴定,将测序结果与NCBI序列比对,结果证实序列相似度基本达100%,确保后续试验的准确进行。本研究通过对不对称PCR扩增中上下游引物比例、杂交体系中PCR产物加入量、杂交温度和杂交时间进行优化,建立了一种可以同时检测4种转基因玉米的液相芯片检测方法。该方法操作快速,在2h内即可完成整个实验。实验结果表明,针对5种目的基因的5条特异性探针均得到了较好的杂交结果,且相互之间无交叉反应,特异性强;利用该方法对不同含量的转基因玉米DNA进行检测,检测极限达0.01%,具有极高的检测灵敏度;并对该方法的重复性进行验证,结果表明变异系数均在8%以内,具有良好的重复性。 本研究建立的4种转基因玉米液相芯片检测方法,可以直接对转基因玉米进行品系特异性检测,最终确定样本中是否含有目的品系。本研究是针对转基因玉米及其产品液相芯片检测技术的一种初步探索,此方法为开展其它品系玉米、大豆、水稻等转基因作物的检测,建立液相芯片技术检测体系奠定了基础,搭建了很好的检测平台。


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