脂肪酸诱导的线粒体自噬功能缺陷介导NLRP3依赖性炎症反应机制的研究

【摘要】：糖尿病是遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等致病因子作用于机体导致的以血糖升高为特征,由胰岛素分泌缺乏或功能障碍引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等失衡的代谢紊乱综合征。胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制。2型糖尿病的诱因有很多,除了高脂饮食,NLRP3依赖性炎症反应毒性也成为其主要诱因之一。自噬是从低等到高等生物中非常保守的细胞稳态维持机制,主要负责及时清除细胞内受损或老化的细胞器及蛋白质。自噬主要影响p细胞的结构,数量和功能,自噬缺陷导致的NLRP3依赖性炎症反应已逐渐成为2型糖尿病研究领域中一个新的研究热点。线粒体作为真核细胞能量代谢中心,其在细胞内的稳态对细胞的正常运行十分重要。当线粒体衰老或发生功能障碍时,为维持细胞的正常运转,细胞一方面会将功能异常的线粒体通过自噬途径清除,这种线粒体清除机制也被普遍定义为线粒体自噬。另一方面,功能异常的线粒体若不能被及时清除即线粒体自噬功能发生缺陷时,就会产生大量线粒体来源的线粒体自由基(mito-ROS), mito-ROS是介导NLRP3依赖性促炎反应的主要诱因之一。越来越多的研究表明炎症反应在2型糖尿病的发生发展中占据着十分重要的作用,然而自由脂肪酸诱导的线粒体自噬缺陷究竟是如何与NLRP3依赖性炎症反应相关联并在2型糖尿病发病过程中发挥着重要作用的,目前国内还外鲜有报道。阐明线粒体自噬缺陷是如何介导NLRP3依赖性炎症反应并诱发糖尿病的,有助于我们对2型糖尿病与线粒体自噬、炎症之间的相互关系有进一步的认识,并为糖尿病治疗提供新的药物治疗靶点。主要实验内容和结果如下：1.构建骨髓源巨噬细胞(BMMs)线粒体自噬缺陷和炎症反应细胞模型，检测细胞中线粒体蛋白与促炎因子的表达情况。本实验采用棕榈酸(Palmitate,PA)诱导小鼠骨髓源巨噬细胞,建立线粒体自噬缺陷模型和炎症反应模型,通过Western Blot和Elisa的方法分别从胞内蛋白水平和胞外分泌蛋白水平检测细胞中线粒体蛋白和促炎因子的表达情况。结果表明PA可抑制BMMs线粒体降解,导致线粒体自噬缺陷；LPS和PA共同作用可诱导BMMs中特定促炎因子IL-1β和IL-18的表达。2. Rheb和KIF5B功能失调驱动线粒体自噬缺陷。Rheb是一种信号传递分子,可与线粒体外膜结合,诱导线粒体自噬；KIF5B则是驱动蛋白家族成员,驱动线粒体沿着微管运动,两者在线粒体自噬诱导过程中均发挥着重要作用。我们采用Western Blot与免疫荧光的方法从分子水平和宏观水平观察在PA的刺激下这两种蛋白在细胞中的表达与分布情况,推测Rheb和KIF5B表达失调驱动线粒体自噬缺陷。3.PA诱导的线粒体自噬缺陷与mito-ROS介导的NLRP3依赖的炎症反应有关。首先,我们采用流式细胞技术检测当PA诱导线粒体自噬缺陷后,mito-ROS在BMMs中的产生情况；然后我们通过Western Blot检测PA诱导线粒体自噬发生缺陷时,NLRP3-ASC-Caspase-1炎症体组成在细胞中的表达情况；最后通过Elisa的方法检测抑制巨噬细胞中mito-ROS产生时促炎因子IL-1p的表达情况,结果表明PA抑制线粒体自噬,导致mito-ROS大量产生,激活NLRP3依赖性促炎反应。主要结论：1.PA可诱导线粒体自噬功能缺陷,抑制受损线粒体降解而使其积累在BMMs中。2.PA诱导的线粒体自噬缺陷主要是由表达失调的Rheb和KIF5B驱动的。3.线粒体自噬缺陷导致细胞中mito-ROS大量产生,激活NLRP3依赖性促炎反应。