粘质沙雷氏菌对花生连作土壤的修复及其高产灵菌红素的研究

【摘要】：花生连作障碍一直是我国农业生产中存在的一个重大的问题,导致我国花生严重减产。尽管历年来已有许多手段试图解决连作障碍问题,但这些方法依旧存在很多局限,不能很好的改善连作障碍所带来的问题。因此本研究第一部分首先尝试通过使用本实验室自主筛选分离得到的粘质沙雷氏菌RZ-21菌株,作为一种生防菌剂,研究它对连作土壤的修复作用。为了确定粘质沙雷氏菌RZ-21在连作花生土壤中的修复作用,我们在自然条件下设计了一组盆栽实验,分别设置四个处理组,分别是粘质沙雷氏菌活菌发酵液RZ-21、等量灭活的粘质沙雷氏菌发酵液M、等量的无菌发酵培养基P以及等量的无菌水作为对照组CK,分别检测了花生不同生长时期土壤微生物含量、微生物区系变化、土壤中病原菌含量以及土壤酶活变化,此外还在纯培养条件下检测了粘质沙雷氏菌对两种典型病原菌尖孢镰刀菌Al和青枯劳尔氏菌B1的拮抗效果,最终还检测了花生成熟期的各项农艺指标。结果发现粘质沙雷氏菌RZ-21能够显著抑制这两株病原菌的生长,且降低了它们在土壤中的含量。RZ-21处理组显著增加了花生荚果产量、藤干重、根瘤数以及主根长,分别增加了 62.3%、33.0%、72.0%以及61.4%,其次为M处理组,P处理组也能稍微增加根瘤数以及根长。同时,RZ-21处理在不同时期增加了土壤脲酶、蔗糖酶以及过氧化氢酶的活性。此外RZ-21及M处理组增加了三个关键时期土壤中细菌的含量,并降低了真菌量,除花期之外,M处理并未增加真菌含量。以上结果说明土壤微生物群落结构得到了平衡,RZ-21菌株能改善土壤环境,增加农作物产量,从而为农业的可持续发展策略提供了有效的依据。根据以上研究结果,结合文献对粘质沙雷氏菌功能的报道,我们推测灵菌红素在抑菌和土壤修复过程中发挥了重要的作用,然而它作为微生物次级代谢产物,产量低,提高该菌的应用价值需要提高菌液中灵菌红素的产量。首先,通过单因素实验,从不同的碳氮源、表面活性物质、脂肪酸、代谢中间体以及金属无机盐中筛选出甘油、FeS04·7H2O、MgSO4·7H2O、MnS04·H20、CaC12及NaAc这六个能有效增加灵菌红素产量的因子,随后经过Plackett-Burman实验从中筛选出最能影响灵菌红素产量的三个因子FeSO4·7H20、甘油和CaC12,再通过最陡爬坡实验,确定这三个因子的中心点,以这个点为中心,根据Box-Behnken中心组合原理设计实验,从而得到产灵菌红素最优配方:蔗糖25g/L、蛋白胨 25g/L、甘油 0.26%、FeSO4·7H2O0.23mM 及 CaC1216.68mM,模型预测该条件下灵菌红素产量为1450.36mg/L,在该最适条件下灵菌红素的实际产量为1447.97mg/L,与原始培养基条件相比,产量提高了 5倍多。其次,我们以优化得到的培养基为基础,将培养环境转移到5L发酵罐上,分别研究低速(250rpm)、中速(300rpm)以及高速(350rpm)条件下,粘质沙雷氏菌生物量、灵菌红素产量、蔗糖消耗量以及溶氧水平DO的变化差异,发现不同条件下差异尤为显著,根据结果制定了一个两阶段转速调控策略,即0-12h,300rpm;12-24h,350rpm。在该条件下,灵菌红素的产量及生产效率得到了显著增加,分别为2167.48 mg/L及90.31 mg/L/h,其产量是最初值的7.5倍。经以上两种方法优化后,我们比较了优化前后两种条件下,灵菌红素合成相关基因的表达量,发现除cop A外,pig F、pig N及cue 这三种基因在转录水平的表达量都显著增加,更好的解释了灵菌红素产量得到了提高这一结论。