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猪心肌高铁肌红蛋白还原酶结构的光谱学研究

陈许明  
【摘要】:pMetMbase A是高铁肌红蛋白氧化还原系统中被新认识的关键酶之一,它的高级结构及功能域有待进一步表征。本实验室以新鲜猪心肌制备得到93%电泳纯度的pMetMbase A为主要研究对象,通过扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、圆二色(CD)和荧光光谱(FS)等方法分别对pMetMbase A的微观形态及光谱学结构特征进行指认,同时探究紫外诱导对这一蛋白酶高级结构及功能域电子传递、氧化还原功能的影响。主要结论如下: 1pMetMbase A进行SEM和XRD超微形态结构观察,该蛋白酶表现为团簇状突起,结晶度达到90.5±8.56%。经XRD数据库比对,发现pMetMbase A分子结构中重要官能团铁卟啉环功能域(heme-Fe)由苝苯并、吡啶、咪唑、甲基胺等化学基团经烷基化而成;其heme-Fe与Mg可能存在相互置换的关系;它的无水结晶以六方晶体为主。 2pMetMbase A二级结构的圆二色光谱指认,在最适CD浓度2.16×10"2mmol/L下,由190~250nm远紫外区(Far-UV) CD光谱指认,pMetMbaseA二级结构包含6种基本肽链卷曲构象;经专用软件拟合,6种二级结构分别为88.1%α-helix(普通和扭曲)、0.8%β-strand(普通和扭曲)、4.1%β-turn和7.1%无规则卷曲,证实pMetMbase A为全α型蛋白。250~310nm近紫外区(Near-UV)呈现出微弱的芳香族氨基酸功能域(P-AAs)和S-S基团信号,表明该酶蛋白的heme含有咪唑基团组氨酸S-S。同时与SP43数据库中43种蛋白质比对,pMetMbase A与它们的相似度小于0.02。与Hb. Mb的CD光谱比对存在显著相位差,说明pMetMbase A具有独特的蛋白质二级结构。 3pMetMbase A结构功能域的荧光光谱指认,P-AAs和heme-Fe分别在311nm(Tyr-),349.5nm (Trp-)和650nm处,且P-AAs和heme-Fe的平均荧光寿命分别为3.00ns和2.41ns, heme-Fe功能域是该蛋白酶的核心活性基团,在电子传递和氧化还原中起着重要作用。 4紫外照射会导致pMetMbase A高级结构的破坏,功能域P-AAs和heme-Fe均出现明显荧光谱带位移,最大红移和蓝移分别达到10nm(p0.01)和21.7nm(p0.01),并伴随荧光强度逐级减弱,说明蛋白质亚基的外周肽链结构遭到破坏,核心区域heme-Fe暴露,使得酶蛋白质三级结构解聚。随着暴露于紫外时间延长至60min,酶蛋白质二级结构也逐渐被破坏,大量α-helix解螺旋,由β-turns和unordered取代,同时heme-Fe由五配位高自旋转化为六配位低自旋,而最终丧失氧化还原能力。


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