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铜绿微囊藻及衍生物对萼花臂尾轮虫生活史特征和抗氧化系统影响的研究

梁叶  
【摘要】:在水域生态系统中,轮虫是初级消费者的重要组成部分,可以影响浮游植物的数量和组成。轮虫数量变动会导致更高营养级鱼、虾、蟹等产量的波动。因此,轮虫类是连接初级生产者与更高营养级的纽带。轮虫类的生长状况和种群变动在水域生态系统动力学中起着关键的作用,定义为“生态交互者(ecological interactor)”。萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)因分布广、个体小、生命周期短、易于培养、对毒物敏感等特点,常作为生态毒理学研究的受试动物。蓝藻是水体富营养化(Eutrophication)的优势种,是导致水华(waterbloom)的主要藻类,这一现象在夏季高温阶段尤为显著。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是研究最多也是危害最大的蓝藻水华之一。微囊藻释放毒素、缺乏关键的营养物质并且会聚集形成群体,从而导致轮虫类生长和繁殖受到抑制。此外,在与微囊藻长期共存的环境中,轮虫能摄食微囊藻,抑制微囊藻的过度繁殖。在微囊藻和浮游动物的相互作用过程中,轮虫类为响应微囊藻和微囊藻衍生物,改变体内生理生化特征和生活史以最大限度地提高自身的适合度。水华微囊藻及衍生物对轮虫的生态学影响是什么?轮虫体内的抗氧化系统在微囊藻衍生物胁迫下发生了怎样的变化?轮虫类响应有毒微囊藻的分子机理是什么?本研究围绕上述科学问题,利用经典生态学和分子生物学方法,着重探讨轮虫耐受水华微囊藻及衍生物的生态学特征和分子机理。1.有毒、无毒铜绿微囊藻对萼花臂尾轮虫生活史和摄食的影响本实验在给定食物密度1 × 105、1 × 106和1 × 107cellsmL-1下,用相同比例体积的小球藻和微囊藻投喂萼花臂尾轮虫,评估用有毒、无毒微囊藻单独投喂以及与蛋白核小球藻混合液投喂的轮虫生命表、生活史特征和摄食强度响应。结果表明在世代时间(T)、净生殖率(R0)、体长、游泳速度和繁殖期食物密度和食物类型出现了协同效应(p0.05)。相反,食物密度和食物类型在内禀增长率(rm)、周限增长率(λ)、产第一窝时间、繁殖后期和每只雌体所产总子代数出现了拮抗效应(p0.05)。轮虫摄食率随摄食时间而下降。尽管微囊藻在摄食后释放的毒素对轮虫生长和繁殖有负面影响,萼花臂尾轮虫改变其生活史特征和摄食强度以响应富营养化的条件。2.有毒、无毒铜绿微囊藻对萼花臂尾轮虫酶活性和营养含量的影响淡水蓝藻铜绿微囊藻会产生微囊藻毒素,该化合物对轮虫有毒害作用。本实验评估微囊藻对萼花臂尾轮虫体内酶活性和营养含量的影响。轮虫用小球藻、斜生栅藻、有毒和无毒微囊藻单独投喂,并用绿藻分别与有毒和无毒微囊藻的混合液投喂。轮虫暴露于微囊藻的环境压力后,测定其体内酶的活性,如:淀粉酶(amylase)、胃蛋白酶(pepsase)、胰蛋白酶(trypsin)、纤维素酶(cellulase),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx);分析营养素含量,如:糖原(glycogen)、蛋白质(protein)和甘油三酯(TG)。单一蓝藻以及与有毒微囊藻的混合液抑制SOD活性(pp0.05)。摄食小球藻和有毒微囊藻混合液的轮虫体内CAT和GPx活性增加(p0.01)。在单一和混合饮食中,消化酶活性与小球藻组相比增加。Glycogen和protein含量在微囊藻混合液投喂的轮虫体内降低,而TG含量增加:轮虫的摄食率(G)随摄食时间下降。在每个处理组中高的摄食率出现在绿藻组。尽管摄食微囊藻后释放的毒素影响轮虫酶活性和营养含量,萼花臂尾轮虫随食物类型改变生理特性和摄食强度以响应不利的水环境。3.藻毒素和氯化铵对萼花臂尾轮虫繁殖性能和表型特征的交互影响在微囊藻水华降解时藻毒素(MC-LR)和氯化铵(NH3-N)同时存在,并对水生有机体有毒害作用。将淡水萼花臂尾轮虫暴露于MC-LR(0、10、30和100μgL-1)和NH3-N(0、270和540μgL-1)以评估这两种毒物对繁殖性能和表型特征的联合影响。单一 MC-LR(1000μgL-1)和NH3-N(540 μgL-1)溶液对轮虫生殖历时和繁殖力有负面影响。繁殖前期、繁殖后期随MC-LR和NH3-N浓度而波动,而繁殖期和每只雌体的总子代数在MC-LR和NH3-N的混合液中下降(p0.05)。轮虫摄食率随摄食时间和这两种毒物的浓度而下降(p0.001)。MC-LR混合NH3-N对游泳速度和体长有负面影响,但刺激了轮虫侧棘刺的发展(p0.001)。这两种毒物对繁殖前期、繁殖期、每只雌体的总子代数、摄食率、游泳速度和体长有协同效应(p0.05)。相反,这些影响对繁殖后期和侧棘刺长有拮抗作用(p0.05)。这些结果表明MC-LR和NH3-N协同和拮抗地对萼花臂尾轮虫繁殖性能和防御表型的形成产生毒性。4.藻毒素和氯化铵对萼花臂尾轮虫生命表参数和谷胱甘肽相关酶的影响本实验将轮虫暴露于不同浓度组合的MC-LR(0、10、50、100和200 μg L-h)和NH3-N(0、740和1.580 μg L-1)混合溶液以评估MC-LR和NH3-N对生命循环参数和氧化压力的联合影响。单一 MC-LR(200μg L-1)和NH3-N(1,580 μg L-1)溶液以及这两种毒物的混合液对轮虫净生殖率(R0)、内禀增长率(rm)和谷胱甘肽酶(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性以及PHGPx基因表达量不利。MC-LR结合NH3-N降低了世代时间(T)、Na+/K+-腺苷三磷酸酶(Na+/K+--ATPase)活性和谷胱甘肽还原酶(GR)活性,但增加了活性氧(ROS)含量(pp0.05)。ROS含量与GSH相关酶活性呈负相关性(p0.01)。MC-LR 和 NH3-N 对R0、rm、ROS 含量和 GSH、GR、GST 活性以及PPHGPx基因表达量有交互影响(pp0.05)。相反,这些影响对T、Na+/K+-ATPase和GPx活性有拮抗效应(pp0.05)。结果表明微囊藻代谢物以协同和拮抗的方式对轮虫产生毒性。轮虫生命循环参数与GSH相关防御系统联系在一起以响应MC-LR和NH3-N。5.藻毒素和亚硝酸盐不同温度下对萼花臂尾轮虫寿命和热休克响应的影响毒性物质如藻毒素(MC-LR)和亚硝酸盐(NO2-N)在蓝藻水华降解时释放,这对浮游动物有不利影响。我们将轮虫暴露于不同浓度的MC-LR(0、10、30和 100μgL-1)和 NO2-N(0、1、3 和 5mgL-1)以评估20、25 和 30℃ 时这些毒物对轮虫寿命和热休克响应的联合影响。轮虫寿命在单一 MC-LR(100 μg L-1)和NO2-N(5 mg L-1)溶液中缩短。热休克蛋白hsps基因的表达量随毒物浓度而波动,而活性氧(ROS)含量在每个温度下每个处理组中增加(pp0.05)。在30 ℃,由MC-LR和NO2-N诱导的氧化压力对寿命和hsps表达有负面影响。在20和25℃,MC-LR和N02-N对寿命和hsps表达有协同效应(p0.05),但在30℃对hsp40和hsp60表达有拮抗效应(p0.05)。温度、MC-LR和N02-N对寿命、ROS含量和hsps表达有交互影响(pp0.05)。蓝藻的代谢物会对轮虫引起毒性并且hsps的表达可作为暴露于MC-LR和NO2-N有用的生物标记。6.藻毒素和亚硝酸盐对萼花臂尾轮虫生长、脂质过氧化和抗氧化响应的影响MC-LR和NO2-N影响水生有机体的生长。将淡水萼花臂尾轮虫暴露于不同浓度的 MC-LR(0、10、50、100和 200μgL-1)和NO2-N(0、2、4、6和 mg L-1)以评估MC-LR和NO2-N对生命循环参数和氧化压力的联合影响。单一MC-LR(200 μg L-1)和NO2-N(8 mg L-1)对轮虫有毒害作用。MC-LR混合N02-N降低了种群增长率(r)、存活和繁殖,但增加活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量(p0.01)。在高浓度的MC-LR或N02-N,SOD和CAT活性以及MnSOD、CuZnSOD和CATmRNA表达量显著降低(p0.05)。轮虫体内ROS的含量与抗氧化酶活性和抗氧化基因的表达呈负相关性(p0.01)。MC-LR和NO2-N对r、繁殖、ROS、MDA含量、SOD活性以及MnSOD和CAT的表达有交互影响(pp0.05)。相反,这两种毒物对存活、CAT活性、GSH含量和CuZnSOD表达有拮抗效应(p0.05)。MnSOD基因在MC-LR和N02-N压力下表达量最高,且MnSOD原核表达纯化后的蛋白在体外30 ℃、pH 9.0和2%SDS诱变剂诱导下活性最高,表明外界不利的环境会影响轮虫的抗氧化效应。这些结果表明MC-LR和NO2-N对轮虫有毒害效应并且认为ROS引起的毒性是由MC-LR和NO2-N诱导损伤的分子机理。7.转录组水平上萼花臂尾轮虫响应有毒铜绿微囊藻的分子机理本实验以种群增长率(r)为指标探讨了萼花臂尾轮虫对有毒微囊藻的耐受性,发现摄食100%有毒微囊藻的轮虫r值下降(p0.05),表明有毒微囊藻对轮虫的种群增长不利。结合RNA-seq技术,将对100%有毒微囊藻投喂的轮虫和100%小球藻投喂的轮虫的转录组进行差异表达基因的比较。数据首次揭示了轮虫响应有毒微囊藻的基因变化主要属于生物学过程、细胞成分和分子功能三大类。这些结果表明萼花臂尾轮虫种群下降的生态学现象与最显著富集的下调通路细胞周期、剪接体、氨基糖和核苷酸糖代谢通路有关,以及与RNA的代谢过程和细胞的衰亡有关,这些通路的下调影响抗氧化系统中酶活性和抗氧化蛋白表达。


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