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基于PP2A/PP5/AMPK-JNK信号通路的异甘草酸镁/二甲双胍抗镉诱导细胞凋亡分子机制研究

陈晓玲  
【摘要】:本研究采用细胞培养、RNA干扰、Western Blot分析、蛋白荧光标记、HE染色、DAPI和TUNEL染色、台盼蓝染色、细胞活性分析等细胞学和分子生物学技术与方法,以ICR小鼠以及L02细胞、AML-12细胞、PC12细胞、SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元为实验对象,通过建立的镉染毒体内和体外模型,综合研究了异甘草酸镁和二甲双胍分别在抗镉诱导肝细胞和神经细胞凋亡中的作用,深入解析了异甘草酸镁和二甲双胍分别通过调控ROS介导PP2A-JNK和PP5/AMPK-JNK信号通路发挥抗肝细胞和神经细胞凋亡分子机理。结果如下:1异甘草酸镁通过抑制镉诱导肝细胞JNK通路激活抗凋亡L02和AML-12细胞、或分别感染Ad-GFP、Ad-dn-c-Jun的L02或AML-12细胞用异甘草酸镁(10-10~4μg/ml或100-800μg/ml或400μg/ml)预处理4 h,或用SP600125(20μM)预处理1 h后再用异甘草酸镁(400μg/ml)预处理4 h,接着镉(50μM)处理6 h或24 h。然后,观察细胞形态、台盼蓝染色统计活细胞数量、DAPI和TUNEL染色评估细胞凋亡表现、Western Blot检测相关蛋白表达。结果显示,异甘草酸镁显著阻止镉引起的L02和AML-12细胞形态皱缩、细胞活力下降、Cleaved-PARP表达水平升高和细胞凋亡增加;异甘草酸镁阻滞镉激活JNK通路抗肝细胞凋亡,这被JNK抑制剂SP600125和钝化c-Jun表达强化异甘草酸镁抗镉诱导肝细胞活性下降和凋亡的证据支持。提示:异甘草酸镁通过抑制镉诱导肝细胞JNK通路激活抗凋亡。2异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS依赖的PP2A-JNK信号通路抗凋亡L02和AML-12细胞、或分别感染Ad-GFP、Ad-PP2A-wt的L02或AML-12细胞用10-10~4μg/ml或100-800μg/ml异甘草酸镁预处理4 h、或用5 m M乙酰半胱氨酸或100 n M冈田酸预处理1 h后再用400μg/ml异甘草酸镁预处理4 h,接着镉(50μM)处理6 h、12 h或24 h。使用CM-H_2DCFDA探针检测细胞ROS水平、台盼蓝染色统计活细胞数量、DAPI染色评估细胞凋亡表现、Western Blot检测相关蛋白表达水平。结果显示,异甘草酸镁逆转镉和/或冈田酸诱导的肝细胞PP2A失活、JNK激活和凋亡;过表达PP2A强化异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞JNK激活依赖的凋亡;异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS产生;乙酰半胱氨酸增强异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS依赖的PP2A-JNK通路抗凋亡。提示:异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS依赖的PP2A-JNK信号通路抗凋亡。3二甲双胍改善小鼠镉染毒模型大脑海马神经元凋亡关联ROS和PP5/AMPK-JNK信号通路变化将36只成年健康ICR雄性小鼠随机分为6组,包括对照组(0.9%生理盐水)、二甲双胍处理组(200 mg/kg体重/天)、两个镉处理组(0.5和1 mg/kg体重/天)、两个二甲双胍(200 mg/kg体重/天)与镉(0.5和1 mg/kg体重/天)联合处理组。实验给药采用灌胃方式,实验周期为6周。采用HE和Nissl染色观察脑组织病理变化、TUNEL染色评估海马神经元凋亡、生化分析脑组织ROS水平变化、Western Blot检测分析脑组织AMPK、JNK、Cleaved-caspase-3等相关蛋白表达水平。结果显示,二甲双胍对镉染毒小鼠脑组织损伤有保护作用;二甲双胍改善小鼠镉染毒模型大脑海马神经元凋亡涉及调节PP5/AMPK-JNK信号通路变化;二甲双胍抑制镉染毒小鼠脑组织ROS水平。提示:二甲双胍改善小鼠镉染毒模型大脑海马神经元凋亡关联ROS和PP5/AMPK-JNK信号通路变化。4二甲双胍抗镉诱导神经细胞凋亡PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元用二甲双胍(1 m M)预处理24 h,然后暴露Cd(10μM和20μM)4 h或24 h。采用MTS检测分析细胞活性、DAPI和TUNEL染色以及线粒体膜电位检测评估细胞凋亡、Caspase-3/7活性分析、Western Blot分析Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达。结果显示,二甲双胍显著抑制镉诱导PC12细胞、SH-SY5Y细胞和原代神经元活性及线粒体膜电位下降,以及阻滞镉诱导细胞Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-3表达和Caspase-3/7活性升高和凋亡增加。提示:二甲双胍抵抗镉诱导的神经细胞凋亡。5二甲双胍调控PP5-JNK信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡PC12细胞、SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元、或分别感染Ad-GFP、Ad-dn-c-Jun、Ad-PP5的PC12细胞用二甲双胍(1 m M)预处理24 h、或用二甲双胍(1 m M)预处理24 h后再用SP600125(20μM)预处理1 h,然后暴露镉(10和/或20μM)4 h或24 h。采用MTS检测分析细胞活性、DAPI染色评估细胞凋亡表现、细胞免疫荧光检测分析p-JNK(Thr183/Tyr185)表达、Western Blot检测相关蛋白表达。结果显示,二甲双胍抑制镉诱导神经细胞JNK通路激活;用SP600125抑制JNK或钝化c-Jun表达强化二甲双胍抗镉诱导神经细胞凋亡;二甲双胍逆转镉诱导神经细胞PP5失活;过表达PP5增强二甲双胍抑制镉诱导JNK通路激活依赖的神经细胞凋亡。提示:二甲双胍调控PP5-JNK信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡。6二甲双胍调控AMPK抗镉诱导神经细胞JNK通路激活依赖的凋亡PC12细胞、SH-SY5Y细胞和/或小鼠原代神经元、或分别感染Ad-GFP、Ad-dn-AMPKα、Ad-AMPKα-ca的PC12细胞用二甲双胍(1 m M)预处理24 h、或用二甲双胍(1 m M)预处理24 h后再用AICAR(2 m M)预处理1 h,然后用镉(10和/或20μM)处理4 h或24 h。MTS检测分析细胞活性、DAPI染色评估细胞凋亡表现;Western Blot检测相关蛋白表达。结果显示,二甲双胍抵抗镉诱导神经细胞AMPK失活;AICAR激活AMPK强化二甲双胍抑制镉激活JNK通路依赖的神经细胞凋亡;钝化AMPKα表达抵抗二甲双胍抑制镉激活JNK通路依赖的神经细胞凋亡,而持续激活AMPKα表达增强二甲双胍抑制镉激活JNK通路依赖的神经细胞凋亡。提示:二甲双胍调控AMPK抗镉诱导神经细胞JNK通路激活依赖的凋亡。7二甲双胍调控线粒体ROS介导PP5/AMPK-JNK信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡PC12细胞、SH-SY5Y细胞和/或小鼠原代神经元用二甲双胍(1 m M)预处理24 h、或用二甲双胍(1 m M)预处理24 h后再用NAC(5 m M)/Mito-TEMPO(10μM)预处理1 h,然后暴露Cd(10和/或20μM)4 h或24 h。使用CM-H_2DCFDA探针检测分析细胞ROS水平、DAPI染色评估细胞凋亡表现、Western Blot检测相关蛋白表达。结果显示,二甲双胍抑制镉诱导神经细胞过量ROS产生;NAC强化二甲双胍抑制ROS介导PP5/AMPK-JNK信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡;Mito-TEMPO增强二甲双胍抑制ROS介导PP5/AMPK-JNK信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡。提示:二甲双胍调控线粒体ROS介导PP5/AMPK-JNK信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡。


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