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组织金属蛋白酶抑制因子-1在肝癌中的功能研究

沈曦  
【摘要】: 组织金属蛋白酶抑制因子家族(TIMP)是金属蛋白酶(MMP)天然的在组织中的抑制因子,TIMPs与MMPs两大酶系之间的平衡是胞外基质(ECM)稳态的重要条件之一。TIMP-1是TIMP家族中第一个被发现的成员,对其的研究一直在不断的深入。目前发现其功能不仅仅局限于对MMP的抑制,而是个多功能的分子。 肝癌不仅是我国,也是世界上高发病率、高死亡率的恶性疾病之一,如何对其进行及时、有效的诊断、治疗一直是医疗界,学术界研究的重点和难点。本论文以BEL-7402肝癌细胞系进行了TIMP-1的功能研究。 1.运用免疫组织化学技术,对肝硬化、肝细胞癌患者以及正常肝的组织中TIMP-1的含量进行了分析。发现在癌组织中存在TIMP-1的高表达,而正常肝组织表达较低,在肝硬化组织中TIMP-1的含量最高,与病理相符;进而对肝癌细胞系BEL-7402,源自癌旁的细胞系QSG-7701及肝细胞系L-02进行了TIMP-1的半定量RT-PCR研究,实验结果也支持在肝癌细胞中存在TIMP-1 mRNA高表达的结论。 2.首次发现TIMP-1在肝癌细胞中的核内分布现象。通过免疫组化研究,发现在肝癌细胞BEL-7402以及肝细胞癌组织切片中,细胞核内均有阳性信号出现,而GFP的亚细胞定位也支持存在TIMP-1的核内分布现象。结合文献报导的一些细胞中的TIMP-1核内分布现象,提示TIMP-1在细胞核内的分布可能不是特殊的情况。运用免疫组化双染色技术,发现TIMP-1的核内分布与PCNA呈现一定的负相关,提示TIMP-1入核的细胞可能不处于活跃增殖的状态。而双氧水的处理可诱导增加TIMP-1的入核。对其可能的机制进行了探讨。 3.对TIMP-1在细胞周期调控中的作用进行了分析。MTT试验以及生长曲线均提示,TIMP-1对肝癌细胞的增殖有抑制作用,但对L-02细胞系无影响,有趣的是,TIMP-1对源自癌旁的QSG-7701细胞系也有一定抑制作用。在哺乳动物细胞中,一系列周期素依赖激酶(cyclin dependent kinases,CDKs) 和周期素*yclins)结合,催化细胞周期进程,周朋素依赖激酶抑制因子 (yClill dCPefldCflt kifl8SC ilthibitofS,CKIS)抑韦它 Ir]的活性或结合,是细 胞周期的负调控因子。对细胞周期的调控存在着多种途径,通过CDK抑制 回了是重要白途径,如pZIv‘”,p27卜”‘等。对TINIPI抑韦增殖白作用机韦 进行的研究发现,TIMP1可上调p“F服告基因的表达,提示TIMPI对 增殖的抑制至少部分是通过上调C*K抑制子pZ/讣’来实现的,该结论也得 到pZI WA”的半定量RTPCR结果的支持。 4.对TIMPJ在细胞迁移中的作用进行了研究。WOund Assay、单细胞迁移检 测等的结果表明,TIMPI还可抑制肝癌细胞的迁移,提示其在肝癌治疗中 的作用。对TIMP-1抑制迁移的内在机制进行了尝试性的研究。因微丝在骨 架的变化与细胞本身的运动中发挥着重要的作用,猜测TIMPl对迁移的影 啊是可能与凋控肌动蛋白微丝的解离和重聚有关。运用免疫组化技术检测 了Factin在转染6U后的变化情况,发现TIMPI位于核内的和分布于胞质的 细胞,细胞核部分经鬼笔环肽处理后信号均较弱,部分细胞膜周边信号较 强,部分细胞则与未转染TIMP-1的类似,即微丝的结构,含量,分布均未 发生显著的变化。 5.研究还首次发现,TIMPI可能作为一种信号分子,通过pZI”’‘途径参与 了IL-6对BEL7402细胞增殖的抑制。MTT试验以及生长曲线均提示,IL-6 对BEL-7402细胞的增殖有抑制的作用。己有研究发现,IL七可在一些细胞 中通过MAPK途径和JAKSTAT3途径对TI*P刁进厅调控。Luciferase Assay 结果表明在BEL7402细胞中,IL七也可通过JAK-STAT3信号转导途径上调 TIMP刁的表达,而之前发现TIMP才又可通过上调pZI“’*对细胞周期进行 负调控,所以IL6对BEL-7402的增殖抑制可能至少是部分出如下的途径介 导的:IL七至通过MAPK和JAK-STAT3途径上调TIMPJ的表达,而TIMPI 又通过对pZI WAF’的上调,抑制细胞增殖,同时STAT3也上调pZI“F’。即 TIMP.l可能作为一种调控因子,参与了IL-6对BEL-7402的增殖抑制作用。 TIMP的这种作为调节因子类似物效应于外部信号的具体机理是什么,是 否还参与了其他的某些生理功能,与其它信号传导子的相互关系怎样,是 否与其在核内的分布有关或有联系,其结构基础是什么,是否涉及其C端 -2- 特性,有待作进一步的研究。 6.在动物体内进厅了 TI


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