中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的PCR克隆及表达

【摘要】：甲壳类的生长包括蜕皮过程中外壳周期性的蜕壳。这个过程受两种相互拮抗的激素调控，即受到蜕皮激素(ecdysone)的刺激作用和蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)的抑制作用。MIH肽产生于端髓X器(MTXO)，储存在眼柄的窦腺中，通过抑制Y器分泌蜕皮激素来调节蜕皮。尽管MIH详细的作用机制仍未清楚，但已经在虾类和蟹类显示MIH可能经环核苷依赖途径抑制蜕皮激素的产生。 通过重组DNA技术，已经从几种甲壳类动物分离、克隆和鉴定了几个编码MIH肽的cDNA。不同甲壳类MIH的cDNA和氨基酸的序列都显示高度的同源性，不仅如此，MIH与CHH家族中其它成员，如甲壳类高血糖激素(CHH)、颚器官抑制激素(MOIH)和性腺抑制激素(GIH)，也显示了高度的同源性。这些激素的成熟肽通常由72-78个氨基酸残基组成，氨基酸的序列相似，均有6个保守的半胱氨酸残基。 中华绒螯蟹(Eriocheir japonicus sinensis)是我国重要的经济蟹类，俗称河蟹。近年来由于不同水系的河蟹种苗混杂，导致河蟹个体变小，严重影响了经济效益。蜕皮是河蟹生活史中重要的过程，但至今对河蟹蜕皮的激素调节尚未进行研究，蜕皮抑制激素的氨基酸序列及其基因的核苷酸序列尚未见报道。本文运用RT-PCR和反向PCR(inverse PCR，IPCR)技术，克隆了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的cDNA和基因，并分析了基因的结构组成。 1．用RT-PCR技术从中华绒螯蟹眼柄总RNA中分离编码蜕皮抑制激素的部分cDNA 根据美洲黄道蟹Cancer magister，可口美青蟹Callinectes sapidus，三叶真蟹Carcinus maenas和斑纹蟳Charybdis feriatus的MIH成熟肽氨基酸序列的密码子使用频率，设计2个简并引物(F1和R48)。以10只蜕皮间期的河蟹眼柄总RNA，经随机六核苷引物逆转录合成第一链cDNA，然后用简并引物经PCR扩增河蟹眼柄cDNA。 结果：经过RT-PCR扩增得到一个与预期大小一样的片段，长163bp。将获得的部分cDNA片段连接到PinPoint~(TM)Xa-1质粒载体中，进行克隆测序。序列分析认为，获得的中华绒螯蟹蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone for Eriocheir japonicus sinensis，Ers-MIH)基因的部分cDNA编码的蛋白与另4种蟹类的MIH肽同源。