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杀虫剂吡虫啉的微生物转化研究

戴亦军  
【摘要】:生物催化和转化技术因其高效性、多样性、底物专一性、区域选择性、化学选择性、对映选择性以及温和的反应条件等特点,被誉为继医药生物技术和农业生物技术之后的“第三次生物技术浪潮”。本文采用微生物转化技术进行新农药的创制。选择了高效,对温血动物低毒的烟碱类杀虫剂吡虫啉(imidacloprid,IMI)为底物,从自然界和菌种库中筛选可转化IMI的菌株,采用静息细胞转化法羟基化IMI,获得了一种IMI羟基化的转化产物5-羟基吡虫啉(5-hydroxy IMI),5-hydroxy IMI经酸、热水解可得到文献报道的杀虫活性提高10-16倍的烯式吡虫啉(olefin IMI)。 以IMI为唯一氮源进行富集培养,从土壤中筛选到了7株可将IMI转化为一种极性更大的化合物的菌株。其中一株命名为NJ1的菌株具有较高的转化IMI的能力,转化样品经HPLC/MS分析,证明该极性更大的转化产物为IMI的羟基化衍生物。采用BioMerieux Vitek自动微生物分析仪鉴定,NJ1菌株被鉴定为Stenotrophomonas maltophilia;16S rDNA结果分析进一步证明了NJ1菌株与在系统发育地位上属于S.maltophilia。从菌种库中筛选结果表明,与NJ1菌株属于同一个种的S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株的转化能力高于NJ1菌株。S.maltophilia CGMCC1.1788被选为进一步研究用菌种。 S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株发酵条件研究结果表明,培养温度介于20至35℃之间,羟基化酶活性几乎没有变化,而最适生长温度为30℃;最高羟基化酶活性出现在对数生长期中期之后;苹果酸和麦芽糖为最适生长碳源,琥珀酸和乙酸钠为羟基化酶活性碳源,乙酸钠为最适比酶活力碳源;牛肉膏为最适生长氮源,酵母膏和玉米浆分别为最适羟基化酶活性和比酶活力氮源;各种吡啶类化合物和咪唑烷类化合物作为诱导剂添加到培养基中,测试结果表明酶形成不需要诱导剂诱导。 5-hydroxy IMI合成条件研究结果表明,酶活性受通气量影响较大,摇瓶装液量越少,酶活性越大,摇瓶转速越高,转化活力越高;最适转化温度为25℃;在转化液中添加蔗糖、葡萄糖和苹果酸等促进剂可显著提高酶活性,添加5%(w/v)蔗糖的转活性较对照组提高了近9倍;最适羟基化酶活性pH为6.5;底物最适浓度为0.01%。


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