雌激素受体α66介导乳腺癌细胞对紫杉醇耐药的研究

【摘要】：乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。美国癌症协会研究表明,乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤,死亡率仅次于肺癌居第二位。随着我国经济的不断发展,近些年来乳腺癌发病率已位居女性恶性肿瘤首位。如何有效提高乳腺癌综合治疗效果,降低发病率和死亡率,已成为当前乳腺癌研究重点之一 乳腺癌组织中雌激素受体(Estrogen receptor, ER)的状态被广泛认为是预测患者对内分泌治疗反应性和预后的关键指标之一。雌激素受体主要有两个亚型,即ERa和ER6。由于剪切异构体的存在,ER66尚有三个亚型,即ERa66, ERa46和ERa36,其中ERα66即为通常所说的ERα,也简称为ER66。大量临床试验和回顾性研究都表明ER66阳性的乳腺癌患者对化疗的反应性不如阴性患者敏感,ER66可能影响乳腺癌患者化疗的有效性。紫杉醇是乳腺癌化疗最有效的药物之一,近些年来大量的临床试验表明ER66可能影响乳腺癌患者对紫杉醇的敏感性。本课题研究了转染ER66 (BC-ER)和转染空质粒(BC-V)的乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性的差异及可能机制。具体内容如下： 1.乳腺癌细胞的转染 我们将pcDNA3.1-ER66和pcDNA3.1空载体转入ER66-的Bcap37乳腺癌细胞,进行RT-PCR和Western-blot鉴定,建立稳定转染细胞株,即转染ER66的BC-ER细胞和转染空载体的BC-V细胞。 2. BC-ER和BC-V乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性差异的研究 以建立的同源细胞模型(BC-ER和BC-V细胞)为基础来研究ER66的表达对紫杉醇敏感性的影响。用MTT法和流式PI染死细胞法检测BC-ER(转染ER66)和BC-V(转染空质粒)细胞对紫杉醇的敏感性。实验结果表明在E2作用下BC-ER细胞较BC-V细胞对紫杉醇耐药。 3. BC-ER和BC-V乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性差异的机制研究 (1)细胞增殖速度在BC-ER和BC-V乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性差异中的作用研究 化疗敏感性和细胞增殖速度有一定关系,增殖慢的细胞对化疗耐药。MTT结果提示E2可以抑制BC-ER细胞的增殖活力,我们进一步检测了BC-ER和BC-V在E2作用下细胞周期和周期蛋白D1的表达变化,结果提示,在BC-ER细胞,E2作用下G2/S期细胞减少,周期蛋白D1表达下调,提示E2作用可抑制BC-ER细胞的增殖速度。推测BC-ER细胞在E2作用下细胞增殖速度的减慢可能对紫杉醇耐药有一定的影响。 (2)细胞凋亡通路在BC-ER和BC-V乳腺癌细胞对紫杉醇耐药差异中的作用研究 BC-ER和BC-V乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性差异的研究表明Bcap37细胞表达ER66后可降低其对紫杉醇的敏感性,接下来我们检测了ER66在紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡中的可能作用。用Western-blot检测两种细胞在紫杉醇作用下凋亡蛋白caspase3的表达差异,结果表明在BC-ER细胞E2作用下可以抑制紫杉醇诱导的caspase3酶原活化裂解,而转染空载体的BC-V细胞没有此变化,也就是说在BC-ER细胞ER66可以通过caspase3途径抑制紫杉醇的促凋亡作用。在具体机制上,我们用Western-blot检测了凋亡信号通路蛋白NF-κB/Iκ-Bα, JNK和AKT的表达及磷酸化状态的变化。结果提示,紫杉醇作用下可以引起BC-ER和BC-V细胞IK-Ba磷酸化降解。而在转染ER66的BC-ER细胞,E2可抑制紫杉醇诱导的IK-Ba磷酸化降解,在转染空载的BC-V细胞没有发现E2对Iκ-Ba有明显影响。推测NF-κB/Iκ-Bα通路可能在BC-ER细胞对紫杉醇耐药上起一定作用。JNK和AKT通路我们只是初步的研究,对于它们在ER66介导紫杉醇诱导凋亡中的具体作用仍需要深入研究。