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大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马PI3K/Akt信号通路及PTEN的表达与认知功能障碍相关性的研究

姚丹  
【摘要】:第一部分围产期缺氧缺血性脑损伤动物模型的建立及建模成功的鉴定 目的: 建立新生大鼠围产期缺氧缺血性脑损伤动物模型,并鉴定模型是否建立成功。 方法: 选用新生7日龄SD大鼠40只,分为假手术组(n=18)和缺氧缺血模型(HIBD)组(n=22)。参照Rice法,并采用Nakajima等改良的动脉结扎法制作新生大鼠HIBD动物模型,即在乙醚麻醉下行左侧颈总动脉结扎并剪断,置于通入氮氧混合气(92%N2、80%02)的缺氧箱中缺氧2h。假手术组只游离而不结扎剪断左侧颈总动脉,不予缺氧处理。观察缺氧缺血后24h内大鼠神经行为的变化,并于建模后72h处死,观察脑组织病理形态学改变。大鼠满28日龄时进行Morris水迷宫实验,观察大鼠的学习记忆及认知能力。 结果: 与假手术组相比,HIBD模型鼠的运动行为落后,大体解剖、Nissl染色均有明显改变,水迷宫结果提示出现学习记忆和认知能力障碍。 结论: 本实验所用方法建立的围产期缺氧缺血性脑损伤动物模型成功可行,为进一步研究提供了可靠的模型。 第二部分大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马PI3K/Akt信号通路及PTEN的表达与分布 目的: 探讨缺氧缺血条件下海马区三磷酸肌醇激酶(phosphoinositid 3-kinase/Akt, PI3K/Akt)信号通路的激活及PTEN的表达,推测PI3K/Akt信号通路与PTEN表达调节的关系,以期更确切地阐明PI3K/Akt信号通路在发育期脑缺氧缺血性损伤(hypoxia ischemia brain damage, HIBD)后的作用。 方法: 7日龄SD大鼠110只,随机分为正常对照组(n=39)、假手术组(n=39)、实验组(n=32)。参照Rice法,并采用Nakajima等改良的动脉结扎法制作新生大鼠HIBD动物模型。假手术组只游离而不结扎剪断左侧颈总动脉,不予缺氧处理。正常对照组不作任何处理。于建模后4h处死动物取脑组织应用免疫荧光法检测AKT、PTEN蛋白的分布和表达;分别于建模后1、4、12及24 h处死动物取脑组织,应用Western blot检测AKT、p-Akt及p-PTEN蛋白的含量。 结果: 脑缺氧缺血损伤后早期p-Akt和p-PTEN都有不同程度的表达增加,但不同步,其中p-Akt高峰较早,在4h,而p-PTEN的高峰稍延迟,在12小时,与假手术组表达的比较均有差异。假手术组各时间点p-Akt和p-PTEN均有极少量弱阳性表达。HIBD模型组p-Akt蛋白表达在4h和12h时间点明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05);p-PTEN蛋白表达于4h,12h和24h明显高于假手术组,差异有统计学意义(P0.05)。AKT蛋白表达随术后时间的延长无明显变化,与假手术组比较差异无统计学意义(P0.05)。 结论: 发育期大脑HIBD后早期可激活PI3K/Akt信号通路,p-Akt表达增高,但同时PTEN也被激活,从而抑制了p-Akt的表达,最终导致神经元的损伤。期望能针对PI3K/Akt信号通路和PTEN寻找到防治新生儿HIBD的更好方法,为开发出以AKT/PTEN为靶点的神经保护剂治疗缺氧缺血脑病提供了理论依据。 第三部分PI3K/Akt信号通路对缺氧缺血性脑损伤大鼠认知功能的影响 目的: 研究PI3K/Akt信号通路对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠学习记忆及认知功能的影响。 方法: 于制备新生大鼠左脑HIBD模型前30min,应用脑立体定位仪定位大鼠左侧海马区,注射Wortmannin 2μl,建立Wortmannin干预HIBD组,同时建立DMSO (Dimethyl sulfoxide)干预HIBD组、HIBD模型组,假手术组及空白对照组。于建模后4h处死动物取脑组织,应用Western blot检测p-Akt蛋白表达情况。于大鼠28日龄时用Morris水迷宫实验测试各组大鼠的学习记忆能力。 结果: HIBD后4小时,Wortmannin干预HIBD组的p-Akt蛋白的表达明显下降,与DMSO干预HIBD组及HIBD模型组比较差异有统计学意义(P0.001)。28d后,空白对照组和假手术组大鼠的水迷宫数据之间无统计学差异(P0.05),HIBD组和DMSO干预HIBD组大鼠的数据之间也无统计学差(P0.05),但Wortmannin干预HIBD组的学习记忆能力显著低于HIBD组和DMSO干预照HIBD组(P0.05),同时非常显著低于假手术组和空白对照组(P0.001)。 结论: PI3K/Akt信号通路是一个经典的抗凋亡、促存活的信号转导途径,对缺氧缺血性脑损伤后神经细胞的凋亡起重要的调控作用。应用Wortmannin (PI3K/Akt信号通路抑制剂)可以加重HIBD新生鼠神经细胞的损伤,进而加重其认知功能障碍,从而影响远期的学习记忆及认知功能。


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