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致泻大肠埃希菌的分子分型和流行病学研究

孔海深  
【摘要】:目的 腹泻是一种世界流行性疾病,是发展中国家婴儿和儿童发病和死亡最常见的原因之一,由各种致泻大肠埃希茵(DEC)引起的腹泻是全球许多国家重要的公共卫生问题。本研究的目的是通过DEC的分子鉴定与分型从而了解浙江地区急性腹泻患者DEC的发生率、类别、血清型、毒力基因分布特点,及其与年龄、性别、季节、地区分布的关系;明确DEC血清型别与毒力基因分布关系;探讨主要血清型鉴定DEC的可行性。 方法 针对六种致泻大肠埃希菌的12种毒力相关基因(bfpB, escV, stxl. stx2、elt. estla、estlb、invE、pic、aggR、astA、daaD)合成相应的引物,建立同时检测五种致泻大肠埃希菌(EPEC、EHEC、ETEC、EIEC、EAEC)的多重PCR (mPCR)方法和测定DAEC的单重PCR方法;将建立的单重和多重PCR方法用于检测浙江省5个地区(包括杭州、宁波、绍兴、丽水、衢州)2009年6月~2010年8月间1500例急性腹泻患者粪便标本的DEC,常规培养法检测其它致病菌;血清学试验测定DEC的O、H血清型;比较DEC和其它肠道病原菌的发生率;比较DEC类别与年龄、性别、季节、地区分布差异;分析DEC主要血清型、毒力基因及其两者的相关性;比较分析100份临床标本培养菌落和粪便标本直接mPCR法测定DEC的符合率。 结果 1.2009年6月~2010年8月浙江省1500例急性腹泻患者中,共分离病原菌401株(26.7%),其中DEC 191株(12.7%),占所有病原菌的47.6%。同期检出其它典型致病菌沙门菌12株(0.8%),志贺菌6株(0.4%)。191株DEC中,EAEC分离最多122株(63.8%),其次为ETEC46株(24.1%),EPEC15株(7.9%),EHEC7株(3.7%),EIEC1株(0.5%),未检到DAEC。 2.成人组DEC和ETEC的检出率(14.6%、4.3%)高于婴幼儿组(11.0%、13%)和儿童组(4.5%、1.1%),三者有显著性差异(p=0.009、0.004);而EPEC EHEC、EIEC、EAEC三组之间无统计学差异。 3.191株DEC在在5个地区DEC、EAEC、ETEC检出有地区差异(p=0.001、0.003、0.01 0),检出率绍兴最高,杭州次之,其它地区略低,而EPEC、EHEC EIEC无地区差异。 4.789例男性和711例女性急性腹泻患者中,ETEC的检出率男性(3.8%)高于女性(2.2%),而EHEC的检出率女性(0.8%)高于男性(0.1%),但包括其它DEC和总DEC均未达到统计学差异。 5.1500例急性患者冬春季节和夏秋季节DEC的检出率有一定差异,DEC和ETEC的检出率夏秋季(13.7%、3.6%)高于冬春季(8.8%、0.7%),两者有显著性差异(p=0.036、0.014),而EPEC、EHEC、EIEC和EAEC无显著性差异。 6.191株DEC中,65株(34.0%)得到分型,分属21种O血清型,位列前3种(占46.1%)血清型为O6(15,23.1%)、O25(9,13.8%)、O169(6,9.2%)。其中EPEC检到4种不同血清型;EHEC检到1种血清型O157:H7ETEC检到8种,主要血清型为O6、O25、O159;EAEC分属17种血清型,主要血清型为O6、O15、O169;EIEC未检到血清型。 7.191株DEC携带10种毒力相关基因共18种模式,主要的基因模式为astA(90株,47.1%)、estla+ estlb (31株,16.2%)、elt(9株,4.7%);65株已分型菌株中,29株(44.6%)携带astA,17株(26.2%)携带estla+ estlb,6株(9.2%)携带elt;前3种血清型06携带的主要基因型为estla+estlb和astA,025主要的基因型为elt,0169主要的基因型为astA; 126株未分型菌株中,61株(48.4%)携带astA,14株(11.1%)携带estla+ estlb。 8.基于菌落法和粪便标本直接基因组DNA mPCR法测定100份临床标本DEC,两法测定结果完全一致89例(阳性12例、阴性77例),不一致11例(仅前者阳性5例,仅后者阳性4例,阳性不同种2例),两法符合率89%。 结论 1.浙江地区DEC的分离率较高(12.7%),是急性腹泻的主要病原菌(占比47.6%),至少存在5个群,主要为EAEC,其次是ETEC, EPEC、EHEC、EIEC少见,DAEC罕见。 2.DEC在不同年龄、地区、季节有一定的分布特点,但未见统计学上的性别差异。 3.本地DEC的血清分型率较高(54.0%),至少存在21种O血清型,主要血清型为06、025、0169,与毒力基因astA、estla+ estlb、elt的分布存在一定关系,可用于初步分型。尽管其在鉴定部分血清型方面是有用的,但单用血清分型法鉴定DEC尚显不足。 4.DEC菌株携带的毒力相关基因呈现多样性,主要基因模式为astA、estla+ estlb、elt,已分型和未分型菌株携带基因基本一致。一些血清型具较高的基因携带率,06、0169血清型主要携带astA、estla+ estlb,O25血清型携带elt较高。 5.粪便标本基因组DNA直接测定和培养分离菌落mPCR法测定DEC有较高的符合率(89%),在细菌性群体爆发腹泻和食物中毒的应急检测中可望发挥一定作用。


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