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SiRNA干扰技术稳定下调基因osterix在骨髓基质干细胞中的表达

唐经励  
【摘要】:目的:检测特异性的转录因子osterix对骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞以及软骨细胞途径的影响,且与外源性BMPs长期培养对骨髓间充质干细胞诱导分化各途径的效应相比较。同时,BMP-2能代表性的诱导种子细胞分化为成骨细胞或软骨细胞。因此该实验合成并构建特异性的细胞系,可稳定下调基因osterix的表达,且抑制骨髓间充质干细胞诱导分化软骨细胞系后期出现的肥大变性时基因指标的表达,从而促进软骨组织工程临床应用和推广。 方法:构建特异性的慢病毒载体,其带有攻击目的基因osterix的shRNA序列,通过转染液介导后可转染骨髓间充质干细胞,干扰并致基因osterix沉默效应,稳定下调基因osterix的表达。同时挑选已公开的不针对基因osterix的靶基因,构建慢病毒载体行阴性对照。最后另一组为BMP-2为主要诱导剂的诱导液,促进骨髓间充质干细胞诱导分化。分别于不同时间点观察并行ELISA检测各组碱性磷酸酶表达水平,组织染色(阿尔新蓝染色以及茜素红染色)检测成骨细胞系以及软骨细胞水平,行实时定量PCR检测各组目的基因表达水平,行Western blot检测各组目的蛋白表达水平。 结果:基因osterix下调组基因osterix表达降低,多数成骨型指标如Runx2,10型胶原蛋白下降,同时成软骨性指标如2型胶原蛋白等基因以及蛋白表达量增加。BMP-2诱导组多数基因以及蛋白表达情况基本与osterix下调组相反。 结论:BMP-2对骨髓间充质干细胞成骨分化诱导增强,效果明显;对软骨途径诱导分化时,效果较osterix基因沉默组效果差。基因osterix下调二十一天内可明显抑制骨髓间充质干细胞成骨细胞系诱导分化的途径,且显著增强骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的途径,且诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞时后期出现的类软骨细胞肥大变性现象通过对成骨关键性基因osterix的下调可显著抑制。稳定下调基因osterix的表达水平可明确增强骨髓基质干细胞表面软骨细胞系显型表达,将有效阻抑长期培养后软骨细胞系肥大性显型基因的表达水平,从而对解决广泛大量培养的骨髓基质干细胞诱导分化为软骨细胞后期出现的肥大变性的问题提示了方向。


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