宫内不同环境诱导肺动脉高压内皮细胞的表观调控机制研究

【摘要】：大量的流行病学和实验室研究已经发现宫内生长迟缓(IUGR)患者或低出生体重儿与成人期发生的疾病如2型糖尿病、肥胖、代谢综合症、骨质疏松、高血压、冠状动脉疾病、慢性肾病等密切相关并可以遗传至下一代,此即“成人疾病的发育起源”学说或Barker假说。越来越多的证据揭示了表观调控机制在胎儿来源的成人疾病中起到重要作用。表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰、遗传印迹等。检测DNA甲基化与组蛋白修饰的表观遗传学方法主要由重亚硫酸盐测序技术和染色质免疫沉淀(ChIP)技术。目前IUGR相关的成人期疾病发生的表观遗传调控机制已经有了初步的认识,然而,由宫内不同环境所诱导的肺动脉高压中是否存在表观遗传调控尚不清楚。鉴于现有的资料,我们假设： 1.宫内不良环境所致的新生儿肺动脉高压存在着相关基因的表观遗传修饰的改变。 2.孕期饮食限制所致的IUGR可以引起肺动脉高压相关基因的表观遗传修饰改变,并可持续到成年；而且这些表观改变可以引起个体对低氧等刺激因素高度敏感,导致肺动脉高压的发生。如果在个体发育早期阶段给予适当的干预措施,阻止或逆转IUGR诱导的相关基因的表观修饰,可能对降低成年后发生肺动脉高压有保护作用。 第一部分新生儿持续性肺动脉高压内皮细胞的表观调控机制 .目的： 新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)是指生后肺血管阻力持续性增高,肺动脉压超过体循环动脉压使由胎儿型循环过渡至正常“成人”型循环发生障碍导致右向左分流,临床表现为严重的低氧血症。肺血管内皮细胞由内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)产生的一氧化氮(NO)在PPHN的发病中有重要作用,而内皮细胞eNOS的表达是受到表观遗传调控的。本研究的目的是探索eNOS基因在PPHN发病中的表观遗传调控机制。 方法： 1.大鼠PPHN模型由低氧加消炎痛共同诱导建立。 2.新生大鼠肺血管内皮细胞由磁珠激活的细胞分选技术(MACS)分离获得。Real-time PCR和Western blot用于检测eNOS基因的表达水平,染色质免疫沉淀(ChIP)、重亚硫酸盐测序技术用于分析eNOS基因的表观调控。 结果： 1. PPHN大鼠模型的评估：左室游离壁加室间隔与右室的比重在低氧加消炎痛联合组明显增加。与其它组相比,联合处理组的肺小动脉中层厚度百分率增加最为显著；外膜弹力蛋白所占比率以及内膜eNOS免疫染色也明显增加；α-SMA、弹力蛋白(elastin)、eNOS蛋白表达水平以及血浆脑型利尿肽(BNP)水平也是显著增加。 2. PPHN大鼠肺血管内皮细胞(PVEC)中eNOS基因近端启动子区域的组蛋白H3和H4乙酰化水平明显高于正常对照组；PPHN的eNOS基因启动子总甲基化率虽比对照组要低,但两组之间无显著的统计学差异。eNOS基因的表观修饰改变与增加的eNOS mRNA和蛋白水平相一致。 结论： 1.低氧和消炎痛对大鼠肺血管重构有协同作用,由两者联合诱导的PPHN大鼠模型可以模拟人的PPHN. 2.大鼠PPHN中增加的eNOS蛋白表达与该基因启动子区域增加的组蛋白乙酰化水平和可能的DNA低甲基化密切相关。 3.表观遗传调控可能是PPHN的发病机制之一。 第二部分宫内生长迟缓诱导成年期肺动脉高压内皮细胞的表观调控机制 目的： 宫内不同环境所致的宫内生长迟缓(IUGR)可以引起生后不同程度的肺动脉高压或者肺血管重构,然而,由IUGR诱导的生命后期的肺动脉高压或肺血管变化的发病机制尚不清楚。由于内皮素-1(ET-1)在肺高压的发病中至关重要,我们假设IUGR可引起ET-1基因的表观修饰改变,这种修饰改变可以持续到成年期并能导致其在生后对低氧高度敏感；而且生后早期给予适当的干预措施能够降低这种成年期疾病发生的风险。 方法： 1.大鼠IUGR模型、低氧模型和TSA早期干预模型的建立。 2.肺动脉压力、肺血管重构的评估,PVEC的分离。Western blot用于评估ET-1蛋白的表达,染色质免疫沉淀技术用于分析ET-1基因的组蛋白修饰和转录因子结合程度。 结果： 1.正常6周对照组大鼠和IUGR大鼠的右心室平均收缩压(RVSP)分别为21.6±2.08 mmHg和22.93±1.60 mmHg,两组之间无明显的统计学差异。经低氧处理后,两组的RVSP明显增加,而且IUGR hypoxia组大鼠RVSP较Control hypoxia组升高明显；IUGR hypoxia组大鼠肺动脉中膜厚度的百分率、中膜面积的百分率明显大于年龄匹配的对照组。但经组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A (TSA)干预后,两组间无统计学差异。低氧处理后两组大鼠肺组织α-SMA蛋白表达则明显增加,尤以IUGR组增加更为显著。 2.低氧干预后IUGR组ET-1蛋白表达水平则明显高于对照组,两者具有明显的统计学差异。IUGR大鼠生后1天和6周的ET-1基因核心启动子区域组蛋白H3和H3K9/18乙酰化水平明显高于对照组,而H4改变不明显；但低氧干预后H3、H3K9/18和H4的乙酰化水平则均明显增加。。同样,IUGR大鼠ET-1基因启动子上转录因子HIF-1α的富集程度与H3的改变相似。 结论： 1.低氧诱导IUGR大鼠产生显著的肺高压、肺血管重构以及增加的ET-1蛋白表达。 2. IUGR的低氧反应特性与ET-1基因核心启动子区域增加的组蛋白乙酰化程度和转录因子HIF-1α的富集密切相关。IUGR生后早期TSA干预后可以减轻生命后期由低氧诱导的肺动脉高压与肺血管重构。 3.表观遗传调控可能是IUGR诱导的肺高压的发病机制之一。