稻瘟病菌亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MoMET13）功能的初步研究

【摘要】：本文利用农杆菌介导的ATMT转化技术成功获得一个稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)致病缺陷突变体Wh-672,并鉴定了T-DNA标记的基因MoMET13,进而通过敲除和互补验证对MoMET13的生物学功能做了初步分析。 利用农杆菌介导转化法(ATMT)筛选出一个对大麦和水稻都完全失去致病性的稻瘟病菌突变体Wh-672。Wh-672在CM培养基上菌落生长速率明显减慢,菌落白色,无气生菌丝,不产生分生孢子。采用hiTAIL-PCR的方法扩增了T-DNA右边界的610bp基因组DNA序列,并克隆到pGEM-Teasy载体上。测序和BLAST分析结果显示,T-DNA标记基因编号为MGG_01728.6,该基因位于第1染色体的Supercontig 27内,由1948个碱基组成,编码627个氨基酸,内有2个外显子和1个内含子,T-DNA插入位点在MoMET13基因起始密码上游815bp处。MGG 01728与Sc MET13和Sp MET9的同源性分别为46.9%,48.03%,这些序列属于亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)超家族成员。 通过构建MoMET13基因敲除载体和稻瘟病菌原生质体转化得到96个转化子,并通过PCR和Southern杂交筛选出4个MoMET13基因敲除转化子。突变体表型分析结果表明,△Momet13突变体不能在缺甲硫氨酸的基本培养基上生长,对寄主的致病性丧失,其它表型也与Wh-672突变体完全一致。为了进一步验证突变体Wh-672的表型改变是由T-DNA插入引起的,构建了融合MoMETl3和绿色荧光蛋白基因GFP的互补载体,分别对Wh-672和△Momet13突变体进行了互补转化,获得58个互补转化子。选取转化子672-hb3进行表型互补分析,结果显示突变体的所有表型均得到恢复。通过激光扫描共聚焦显微镜在672-hb3的菌丝、孢子和附着胞内几乎都观察不到GFP绿色荧光,说明MoMET13基因在营养生长、产孢和附着胞形成过程中低水平表达。 生物信息学分析表明,在稻瘟病菌中除MoMET13外,MoMET12也可编码亚甲基四氢叶酸还原酶,它们分别与酿酒酵母(S. cerevisiae)的MET13和MET12同源。为进一步了解稻瘟病菌MoMET12基因的功能,通过构建MoMET12基因敲除载体和原生质体转化得到269个转化子,用PCR的方法筛选出4个敲除转化子,△Momet12突变体与△Momet13突变体类似也不能在缺甲硫氨酸的基本培养基上正常生长,但△Momet12突变体的其它表型(如产孢、致病性等)与野生菌株Guy11基本一致。 综合上述,亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MoMET3)在稻瘟病菌致病过程中起关键作用。