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转Bt基因水稻根际微生物的遗传多样性分析

李春楠  
【摘要】:土壤环境安全性是转基因植物安全性评价中重要的内容,转基因植物可通过不同途径向土壤释放外源基因及其表达产物,对土壤微生物产生选择压,进而可能对土壤微生物产生影响。本文在建立了两种可用于土壤微生物遗传多样性分析新技术的基础上,研究了2个转Bt基因水稻对土壤微生物遗传多样性的影响。主要结果如下: 1.通过对PCR反应成分的测试,建立了可用于植物根际土壤微生物SRAP的适宜反应体系,包含1×PCR缓冲液、2 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.4μmol/L引物,30 ng模板DNA和1 U Taq DNA聚合酶;在对退火温度进行测试的基础上,确定了扩增程序:94℃5min;94℃45s,35℃1 min,72℃1 min 30 s,共5个循环;94℃45 s,50℃1 min,72℃1 min 30 s,共35个循环;72℃延,10min。进一步采用22对引物组合对20种植物根际土壤微生物进行了分析,共获得237个扩增位点,其中多态性位点221个,占93.2%。平均每对引物组合的多态性位点百分数(PPL)、多态性信息含量(PIC)、等位基因单体型(Ah)和遗传杂合度(He)分别为93.78、0.94、18.05和0.92,这些较高的参数一方面说明SRAP对根际土壤微生物的遗传基础具有较强的鉴别能力,另一方面反映了本研究中20种不同植物的根际土壤微生物具有丰富的遗传多样性。2个不同种植地和4个不同发育时期间的根际土壤微生物遗传距离差异极显著,但2个不同水稻品种间的差异不显著。Shannon多样性指数揭示,水稻根际土壤微生物的遗传多样性最低,莴苣的最高。按照非加权类平均法(UPGMA)聚类,在遗传距离0.454的水平上,可将20种植物根际土壤微生物分为三类:第一类是水稻根际土壤微生物,第二类是种植于大棚温室的芹菜根际土壤微生物,第三类为其余18种旱作植物根际土壤微生物。结果证明SRAP是分析土壤微生物遗传多样性的有效手段。 2.采用27对引物组合分别对转Bt基因水稻TT51、华池B6及其对照明恢63和嘉早935的根际土壤微生物进行了SRAP分析。两个转基因水稻TT51与华池B6在同一种植点根际微生物遗传距离无显著差异,但在不同地点(华家池和建德)的遗传距离差异极显著,不同发育时期间的差异则随地点不同而变化;转基因水稻品种TT51和华池B6的根际土壤微生物在各自的4个生育期之间不存在明显差异;两对转基因与各自对照间在不同时期、不同地点种植,根际微生物的遗传多样性均没有差异,表明转Bt基因水稻TT51和华池B6的种植未对根际土壤微生物的遗传多样性产生影响。 3.以含有单个错配碱基的DNA异质双链为底物鉴定了芹菜CELI粗提物的错配切割酶学活性,并对影响其切割错配的反应条件进行了优化,建立了以自制CELⅠ粗提物为基础的点突变酶学检测技术。自制的CELI粗提物能有效地识别和切割DNA异质双链中碱基错配。在当异质双链DNA量恒定时,在一定的范围内CELI粗提物用量的影响不明显,由PCR产物形成的12μL异质双链DNA可用蛋白质总量约900ng的CELI粗提物进行有效切割。常规PCR缓冲液与已报道的CELI缓冲液的效果基本相近,实际工作中可选用PCR缓冲液作CELI酶切反应液;缓冲液pH值对错配切割效果具有明显的影响,适宜的pH约近中性。Zn2+对错配切割具有促进作用,但不是必需的,适宜的浓度为0.25mmol/L。CELI粗提物切割错配的反应时间以42℃下酶切20min为宜。比较试验结果表明,本研究建立技术的点突变检测效果与Transgenomic公司试剂盒SurveyorTM基本相同。进一步将这种点突变检测技术结合于Eco-TILLING,并对水稻根际微生物16S rDNA序列单核苷酸变异进行了分析,证明本研究建立的Eco-TILLING可有效地用于土壤微生物基因多样性分析。 4.分别未标记和荧光标记的Eco-TILLING技术分析了转Bt基因水稻TT51与对照明恢63、转基因水稻华池B6与对照嘉早935根际土壤微生物16S rDNA的差异。TT51根际土壤微生物形成的杂合DNA、TT51与对照明恢63混合后形成的杂合DNA经CELI处理后都产生了相同的切割条带,存在4个单碱基变异,位置分别为134nt、423nt、911nt和1163nt处,转基因水稻与对照间在4个生育期间出现的变异位点相同,表明转基因TT51与对照明恢63土壤微生物16S rDNA片段之间不存在单碱基差异,转基因水稻TT51的种植未对其根际土壤微生物16S rDNA的基因多样性产生影响。


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