MYB对杨梅果实花青素苷合成的调控及其机制

【摘要】：以‘荸荠’(Myrica rubra cv. Biqi)、‘东魁’(M. rubra cv. Dongkui)和‘水晶’(M.rubra cv. Shuijing)三种不同果实颜色的杨梅品种为试验材料,分析了花青素苷与果实色泽之间的关系,克隆得到花青素苷生物合成途径的结构基因和MYB转录因子,采用qPCR技术分析上述基因在不同品种杨梅果实、植株组织器官、果实发育阶段和果实套袋等处理中的表达模式,并开展了转录因子MYB与花青素苷生物合成途径相关编码基因的互作模式研究。通过烟草瞬时表达体系,验证了MYB转录因子的功能,明确了其对花青素苷生物合成途径相关基因的调控模式。主要结果如下： 1、‘荸荠’杨梅果实中花青素苷总量最高,为85.40 mg/100g FW；‘东魁’杨梅果实中花青素苷总量为46.44 mg/100g FW；‘水晶’杨梅果实中检测不到花青素苷含量,三个品种对应的CIRG值分别为7.56、5.27和3.84。分析‘荸荠’杨梅不同组织器官中花青素苷含量,发现叶片中未检测到花青素苷,幼根和幼茎中含有少量的花青素苷,果实的花青素苷总量最高。‘东魁’和‘荸荠’杨梅64DAFB采收的果实中均未检测到花青素苷,随着果实的发育,CIRG值和花青素苷总量呈上升趋势。‘荸荠’杨梅套袋果实中的花青素苷总量仅为0.56 mg/100g FW,未套袋果实中花青素苷总量为108.99 mg/100g FW；未套袋果实CIRG值约为套袋果实的两倍。 2、从成熟的‘荸荠’杨梅果实中克隆得到MrACT (227 bp)、MrCHS (440 bp)、MrCHI (301 bp)、MrF3H (436 bp)、2个DFRs (MrDFR1,221 bp; MrDFR2,221 bp)、MrANS (428 bp)、MrUFGT基因(647 bp)和2个R2R3 MYB基因(MrMYB1和MrMYB2)。从杨梅EST数据库中得到了MrF3'H基因(412 bp)和1个MrMYB3基因(514 bp)。MrCHS和MrF3H基因与其他物种中对应基因的序列同源性高达90%, MrDFR1基因与拟南芥中对应基因的同源性为83%,而MrUFGT基因与其他物种的对应基因的序列同源性介于51%和70%之间,其余基因与其他物种对应基因的序列同源性则介于68%和82%之间。 3、采用RACE技术扩增非编码区序列,得到MrMYB1序列(966 bp)和MrMYB2序列(996 bp),其中MrMYBl为全长。MrMYB1和MrMYB2与拟南芥中R2R3 MYB基因家族成员的序列同源性较高,接近70%,而MrMYB3与拟南芥的MYB同源性仅为55%。MrMYB1和MrMYB2蛋白的序列同源性较高,均含有R2R3结构域。 4. MrCHS和MrCHI在三个不同品种杨梅果实中表达相似,而其他基因在两个有色品种中的表达水平都高于‘水晶’杨梅,MrF3H、MrF3'H, MrDFR1和MrUFGT基因的转录水平与花青素苷含量呈正相关关系。在‘荸荠’杨梅的不同组织器官中,除MrCHI在幼根中表达水平最高之外,其余基因均在成熟果实中表达水平最高,其中MrUFGT基因仅在成熟果实中表达。在‘东魁’和‘荸荠’杨梅果实的不同生长发育阶段,除MrCHI和MrDFR2外,其他结构基因的表达水平和花青素苷总量成正比,且在‘荸荠’果实中的表达水平要高于‘东魁’果实。套袋处理明显抑制花青素苷生物合成途径中的结构基因表达。 5、三个不同品种的杨梅果实中转录因子MrMYB1的表达水平与花青素苷总量呈正相关关系。转录因子MrMYB1只在成熟‘荸荠’果实中表达,而不在根茎叶中表达。‘东魁’和‘荸荠’杨梅的发育过程中,转录因子MrMYB1的表达逐渐增强,并在发育后期达到峰值。在套袋果实中转录因子MrMYB1的表达被显著抑制,表明光照可能通过影响MrMYB1表达进而影响果实花青素苷积累。 6、烟草瞬时表达试验的结果表明,过量表达MrMYB1基因诱导烟草叶片中花青素苷积累。MrMYB1协同bHLH转录因子可激活AtDFR启动子,表明MrMYB1转录因子调控花青素苷生物合成途径中结构基因的表达,从而影响花青素苷合成。 7、从‘水晶’、‘东魁’和‘荸荠’杨梅果实中分别克隆得到各自的MrMYBl全长序列。发现‘水晶’杨梅的MrMYB1(命名为MrMYB1d)在ATG起始密码子后第30位上缺失了一个胞嘧啶,导致移码突变,不能合成正常的MYB1蛋白；‘荸荠’杨梅仅含正常功能的MrMYB1基因,‘东魁’杨梅则同时含有MrMYB1和MrMYB1d基因。上述结果表明,MrMYB1调控杨梅花青素苷合成途径基因的协同表达。