收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

酵母甘油代谢工程与基因组重排构建乙醇高产菌株及相关机理研究

王品美  
【摘要】:乙醇是已被大规模生产与应用的可再生生物能源之一。但目前乙醇生产的总体效率效益低。拥有优良的高产酿酒酵母菌株,实现高效率酒精发酵是提高乙醇生产效益的重要途径之一。优良工业酿酒酵母菌株的选育以往主要采用自然筛选和随机诱变育种的传统方法。应用杂交、细胞融合、基因工程等技术构建优良酿酒酵母菌株有颇多论文报道,但获得工业化大规模应用的高水平成果尚鲜见。其主要原因是高产酒精的优良酿酒酵母菌株需具备耐高糖浓度、耐乙醇、耐酸、适应的温度范围宽、生长与发酵速度快、糖醇转化率高等多重优良性能。而这些性能均非单基因所能控制,性能及其发挥所涉及的许多遗传与调控因子、作用途径与机制等尚待研究,单种剧烈的育种手段,常常导致菌株关键性能退化或衰变。因此获得能大规模生产应用的高产优良酿酒酵母菌株,研究难度极大。本文在总结前人经验的基础上,运用诱变、杂交、细胞工程、基因工程与多种方法相结合的基因组重排等方法的单项改进与集成创新,改良、选育、构建高产优良酿酒酵母菌株,并对有关机制进行了研究探索。研究获得如下结果: 1、筛选优良工业酿酒酵母出发菌株诱导三株工业酿酒酵母菌株THA、S25和C87产孢获得90株单倍体。筛选四株高乙醇产量单倍体z1、Z4、Z8和Z9作为后续育种的出发菌株。将两株交配型确定的出发菌株z1和Z4杂交,获得的杂交重组子在230g/L葡萄糖的醪液中发酵。重组子z14乙醇产量最高,达到100.05g/L,比zl和Z4的亲株THA和S25分别提高1.75%和3.04%。 2、利用RAPD-SCAR分子标记筛选细胞融合重组子针对不具有产孢和交配能力的出发菌株z8和Z9,获得菌株特异的RAPD(随机扩增多态性DNA, Random Amplified Polymorphic DNA)-SCAR(特异序列特征性扩增区域,Sequence Characterized Amplified Region)分子标记,替代传统育种的营养缺陷型标记,筛选菌株Z8和Z9的电融合重组子。在含230g/L葡萄糖的醪液中发酵,重组子与出发菌株Z8和Z9相比,乙醇产量提高4.33~8.08%。 3、实验菌株体系的甘油代谢改造基于酵母甘油代谢调控机制,以降低甘油生成、提高乙醇产量为目标。敲除实验菌株4741内源基因FPS1(编码甘油跨膜运输的通道蛋白Fpslp),并同时表达变链球菌Streptococcus mutans的gapN基因(编码NADP+依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPN)获得改造菌株4FG。与对照菌株相比,改造菌株4FG副产物甘油和乙酸产量分别降低21.47%和27.09%,乙醇产量提高9.18%。因此,在实验菌株体系敲除FPS1基因并同时表达异源gapN基因可有效降低副产物甘油和乙酸生成,提高乙醇产量。 4、工业酵母菌株体系的甘油代谢改造对交配型相异的出发菌株Z1(MATα)和Z4(MATa)分别进行甘油代谢改造,应用kanMX和Zeocin抗性标记替代营养缺陷型标记,敲除FPS1基因并整合表达异源gapN基因。将不同抗性标记的改造菌株KFG (MATa fps1ΔgapN-kanMX)和ZFG (MATa fpslΔgapN-Zeocin)进行杂交,G418-Zeocin双抗平板高效筛选获得杂交重组子FG1(MATa/αfps1ΔgapN-kanMX fpslΔgapN-Zeocin)。在含250g/L葡萄糖醪液中发酵,与Z1和Z4的重组子Z14(MATa/α)相比,基因改造重组子FG1的副产物甘油和乙酸产量分别降低18.14%和25.04%,乙醇产量(114.00g/L)提高4.14%。在工业菌株体系进行相同甘油代谢改造可同样改良发酵性状,但效果与实验菌株体系有所差异。 5、通过改进的全基因组重排技术提高菌株乙醇耐受力以提高酵母乙醇耐受力为育种目标,在甘油代谢改造的基础上,利用紫外和EMS两种诱变方式对菌株KFG (MATαfpslΔgapN-kanMX)和ZFG (MATa fpslΔgapN-Zeocin)进行诱变,为后续全基因组重排提供更加多样化的变异菌群。经过两轮全基因组重排及G418-Zeocin双抗平板的高效筛选,获得乙醇耐受力提高的重组子A1。在8%(v/v)乙醇胁迫条件下,重组子A1最大比生长速率比对照菌株FGl提高23.83%。细胞膜完整性分析表明,重组子A1在乙醇胁迫下细胞膜完整性较高,这可能是其耐受力提高的原因之一。同时,高糖(含285g/L葡萄糖)发酵结果表明,重组子A1发酵前30h乙醇生成速率是对照菌株FG1的1.4倍,发酵时间缩短,最终乙醇产量高达117.61g/L,比FG1提高3.91%。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前12条
1 陶玉敏,曾涛,莫舒园,石艳霞;用模拟退火算法求解无向排列的反转排序问题[J];鞍山科技大学学报;2004年03期
2 陶玉敏;基于免疫算法的无向排列的反转排序问题[J];鞍山科技大学学报;2005年02期
3 付婕琴;胡昌华;;GENOME SHUFFLING技术优化及其应用进展[J];广西轻工业;2010年04期
4 朱欣杰;程瑶;;Genome shuffling在菌种改良中的应用[J];河北化工;2006年07期
5 陶玉敏;;无向反转排序问题的遗传模拟退火求解[J];辽宁科技大学学报;2009年04期
6 王春玲;宋茜;侯丽华;鲁梅芳;曹小红;;耐盐产酯酵母的选育及发酵性能研究[J];中国酿造;2010年06期
7 卢圣国;李霜;罗芳;祝扬扬;熊俊;孟庆雄;;1,3-丙二醇产生菌基因组重排育种[J];微生物学报;2011年04期
8 潘淑勇;;基因组改组构建柔红霉素高产菌株[J];科技创新导报;2011年23期
9 侯丽华;宋茜;曹小红;;酱油风味研究进展[J];中国酿造;2009年07期
10 梁新乐;黄莹莹;张虹;陈敏;刘璇;;响应面法优化桔青霉F-5-5核酸酶P1发酵培养基碳氮源[J];核农学报;2011年01期
11 骆健美;李建姝;王艳婷;王敏;;褐黄孢链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究[J];现代化工;2008年S2期
12 骆健美;李建姝;郭浩;刘峰;刘丹;王敏;;响应面优化褐黄孢链霉菌原生质体再生培养基[J];食品科学;2009年07期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 陈涛;陈洵;王靖宇;班睿;赵学明;;DNA及基因组重排在代谢途径优化中的应用[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
2 刘声田;朱大铭;;基因序列翻转排序的一种近似算法[A];山东省计算机学会2005年信息技术与信息化研讨会论文集(一)[C];2005年
3 戴二黑;;鼠疫耶尔森菌基因组重排谱分型的研究[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
4 何云飞;金志华;;纳他霉素产生菌基因组重排育种[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
5 高福;;2005年的两次传染病流行:野生水禽禽流感与猪链球菌病[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
6 杜云平;周庆丰;余国莲;李小军;梁健良;刘建忠;毕英佐;;Genome shuffling技术在微生物育种中的应用[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(上册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 程艳飞;基因组重排在产纤维素酶斜卧青霉菌种改造中的应用[D];山东大学;2009年
2 郑辉杰;用基因组重排和进化工程进行菊糖芽孢乳杆菌菌种改进[D];天津大学;2009年
3 陈涛;基于基因组重排的产核黄素枯草芽孢杆菌的代谢工程[D];天津大学;2004年
4 王品美;酵母甘油代谢工程与基因组重排构建乙醇高产菌株及相关机理研究[D];浙江大学;2010年
5 王骁力;计算生物学中的组合优化问题的研究[D];山东大学;2005年
6 谢志鹏;发酵法生产米多霉素的菌种选育、培养条件优化和动力学研究[D];浙江大学;2005年
7 沈一飞;生物序列数据比较与模体发现算法研究[D];中国科学技术大学;2006年
8 李文凤;中国家族性/早发性乳腺癌人群中BRCA1和BRCA2基因突变的研究[D];复旦大学;2007年
9 魏培莲;土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探索[D];浙江大学;2007年
10 徐波;始旋链霉菌基因组重排育种、普那霉素发酵条件优化及高产机理分析[D];浙江大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王刚;阿维菌素产生菌基因组重排育种研究[D];河北大学;2013年
2 刁金娜;多拉菌素产生菌基因组重排育种[D];东北农业大学;2011年
3 祁咏春;用基因组重排技术选育L-谷氨酰胺高产菌株[D];山东师范大学;2013年
4 陈建中;基因组重排技术在草菇耐低温菌株选育上的应用[D];上海海洋大学;2013年
5 董计巧;离子注入和基因组重排提高青霉产纤维素酶能力及应用效果研究[D];山东大学;2011年
6 卢圣国;基于基因组重排技术的1,3-丙二醇高产菌株选育[D];昆明理工大学;2011年
7 张大伟;利用基因组重排技术选育土霉素高产菌株[D];河北大学;2013年
8 陶香林;代谢工程与基因组重排相结合构建高浓度乙醇发酵酿酒酵母菌株[D];浙江大学;2012年
9 何小妮;基因组重排技术选育果糖基转移酶生产菌株的研究[D];华南理工大学;2013年
10 张坤坤;基因组改组技术选育高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌[D];江南大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978