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微囊藻毒素对人羊膜细胞蛋白磷酸酶2A的影响及Endo-Porter作为微囊藻毒素转运体的可行性研究

梁婧  
【摘要】:微囊藻毒素(microcystin, MC)是一种富营养化水体毒素,化学性质稳定,很难将其从水中除去,而且该毒素具有多种毒性效应,深入研究其毒性机制有着非常重要的意义。 MC是一种单环七肽,其中5个氨基酸为固定成分,X,Y为两种可变氨基酸,由此可产生80多种同类物。其中存在较多、毒性较大的是MCLR, L、R分别代表亮氨酸、精氨酸。MCLR是蛋白磷酸酶2A (Protein phosphatase 2A,PP2A)的强效抑制剂,对PP2A的特异性抑制可能是造成其毒作用机制错综复杂的原因之一。然而到目前为止,关于MCLR与PP2A蛋白表达情况及活性的关联研究尚不多见。本实验室前期研究发现MCLR可引起人羊膜细胞FL中PP2A-A的表达升高。为进一步探索PP2A与MCLR毒性效应的相关性,本研究对MCLR暴露后PP2A的改变情况进行了深入探讨。 此外,微囊藻毒素的毒性效应有明显的器官选择性,主要表现为肝毒性。这是由于肝脏中表达特殊的有机阴离子转运多肽系统OATPs,可将MCLR大量地转运入细胞。而且近来的研究发现微囊藻毒素对其它不表达或低表达OATPs的脏器也有影响。因此,本研究同时探讨了加入外源性多肽转运体Endo-Porter后MCLR对FL细胞的毒性效应,为今后在不/低表达OATPs细胞中研究MCLR的毒性机制奠定了基础。 本研究主要内容包括:MCLR进入细胞后与PP2Ac的结合;MCLR作用后PP2A活性改变及亚基的变化;从微管翻译后修饰的变化研究MCLR染毒后对PP2A调控微管的影响;加入转运体后看MCLR产生的多种毒性效应的变化。采用MTT法检测细胞活力;用实时定量PCR检测mRNA表达的改变情况;用免疫印迹法检测目的蛋白表达的变化;用PI单染法分析细胞周期的改变情况;用Annexin V-PI双染法检测毒素诱导的细胞凋亡率;用免疫荧光技术检测细胞微管形态的变化及目的蛋白相互结合的情况。 主要结果: 1.短时间低浓度MCLR暴露引起PP2A活性上升,C亚基mRNA和蛋白表达上升,磷酸化水平下降,甲基化水平下降。 2. MCLR暴露后微管蛋白表达及形态没有发生变化,但与酪氨酸化微管结合的PP2A-B55a减少。 3. MCLR染毒虽然使PP2A多种调节亚基rnRNA发生变化,但并没有导致蛋白表达发生变化。 4. MCLR被EP大量转运入细胞后产生一系列毒性效应,抑制PP2A活性、抑制细胞增殖、诱发细胞凋亡、引起ROS水平上升、Bax/Bcl-2比值升高。 5. MCLR被EP转运入细胞后,激活ERK1/2/ JNK/ p38。实验进一步证明MCLR激活了MEK1/2-ERK1/2-Myc通路,且呈时间依赖性。 6. MCLR被EP转运入细胞后可引起细胞周期阻滞,并同时检测到cdc25C磷酸化水平上升。 主要结论: 1. MCLR染毒诱发的细胞内毒物兴奋效应使得C亚基mRNA表达和蛋白表达水平上升,从而使PP2A酶活性上升。 2. MCLR染毒使PP2A-B55α与酪氨酸化微管的结合能力下降从而影响了PP2A对微管酪氨酸化的调控。 3.PP2A的nRNA表达比蛋白表达更容易被毒素影响发生变化。 4.通过MCLR被EP大量转运入细胞后产生的一系列毒性效应证明EP可作为MCLR的转运体。 5. MCLR被EP大量转运入细胞后激活MEK1/2-ERK1/2-Myc,证明ERK1/2通路在MCLR诱导FL细胞凋亡的过程中起着重要作用。 6. MCLR被EP转运入细胞后引起的cdc25C磷酸化水平上升与周期阻滞有关。


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