肝再生磷酸酶-3与上皮性卵巢癌转移的相关性及其可能拮抗剂的治疗

【摘要】：卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其死亡率超过女性其他生殖部位肿瘤之和,卵巢癌死亡的的最重要原因是肿瘤转移,但卵巢癌并不能在早期就预测转移,因此不断寻找能预测早期转移的新指标和有效治疗卵巢癌的新药物一直是医疗界的新课题。 肿瘤转移是一个多基因、多因素、多步骤的复杂过程。蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTP)可以调节细胞的生长、分化、信号传导和细胞周期,与肿瘤密切相关。肝再生磷酸酶(the phosphatases of regenerating livers, PRLs)家族是近年来发现的细胞内蛋白酪氨酸磷酸酶的新癌基因家族,常被看做新的生物标记物和肿瘤治疗靶点 2001年底Saha等首次证实PRL-3与结肠直肠肿瘤转移有关,此后也有许多学者在多种肿瘤研究中证实了PRL-3与肿瘤转移有关,但少见PRL-3与卵巢肿瘤关系的报道。Zeng等人发现转染PRL-3后的中国仓鼠卵巢细胞体外迁移和浸润能力明显增强,能在裸鼠体内形成转移灶。2005年Polato首次证实PRL-3与卵巢癌进展有关,把PRL-3看作是对抗恶性肿瘤的新靶点。 我们检测了数十例卵巢癌患者原发灶和转移灶PRL-3的表达,发现卵巢癌也高表达PRL-3,尤其在转移灶中,证实PRL-3与卵巢癌转移有关。我们设想利用外源性药物抑制PRL-3来达到卵巢癌靶向治疗的目的。 研究显示黄酮类化合物有抑制肿瘤增殖作用,棕矢车菊素(Jaceosidin)是花色素类黄酮,可以阻断蛋白激酶磷酸化和引起细胞凋亡。我们希望其通过抑制PRL-3途径来抑制卵巢肿瘤转移。我们发现棕矢车菊素可以通过线粒体途径诱导卵巢癌细胞凋亡来抑制卵巢癌细胞增殖,但对PRL-3无明显抑制作用。 Pathak报道了抗寄生虫药喷他脒(pentamidine)在黑色素瘤裸鼠模型中的抗肿瘤作用及可耐受剂量,证实喷他脒是一个PRL的抑制剂和新型PTP酶靶向治疗剂。受此启发,我们通过喷他脒对卵巢癌SKOV3(?)细胞及其裸鼠移植瘤PRL-3的抑制作用,探讨喷他脒治疗卵巢癌的安全性、可行性,从而使卵巢癌的治疗有一个新的选择。 第一部分肝再生磷酸酶-3的表达与上皮性卵巢癌转移相关性 目的： 检测肝再生磷酸酶3 (PRL-3) mRNA在上皮性卵巢癌及其转移灶中的表达,探讨其与上皮性卵巢癌发生发展以及侵袭转移的生物学行为之间的关系。 方法： 以22例正常卵巢组织为对照,通过半定量PCR测定84例上皮性卵巢癌原发灶及58例大网膜转移灶PRL-3 mRNA相对表达水平,并分析其表达水平与临床病理学指标的关系。 结果： 1.84例卵巢癌组织中PRL-3基因表达量显著高于正常卵巢组织。 2.58例转移灶PRL-3基因表达量显著高于原发肿瘤。 3.PRL-3基因表达水平与肿瘤远处转移有相关性,而与临床分期、肿瘤病理类型、分化程度及年龄均无关,与三年生存率有关。 结论： PRL-3基因表达与上皮性卵巢癌进展相关,PRL-3可能成为判断上皮性卵巢癌转移高危因素的一个生物标志物。 第二部分棕矢车菊素经由线粒体途径诱导人类卵巢癌SKOV3细胞的凋亡及其对人卵巢癌SKOV3细胞PRL-3表达的影响 目的： 探讨黄酮类化合物棕矢车菊素对人卵巢癌SKOV3细胞的的抑制途径及对卵巢癌细胞PRL-3的抑制作用。 方法： 1.利用MTT法检测不同浓度的棕矢车菊素作用下人卵巢癌SKOV3和Caov-3细胞增殖能力。 2.流式细胞仪法检测细胞凋亡情况。用不同浓度的棕矢车菊素处理24小时。Annexin-V/PI染色用于检测凋亡率。流式细胞术测定细胞凋亡。 3.利用JC-1染色分析法进行细胞线粒体膜电位分析。 4. RT-PCR检测棕矢车菊素处理的SKOV3细胞内源性PRL-3的mRNA表达。 结果： 1.在特定的剂量下,棕矢车菊素显著减弱了人卵巢癌SKOV3和Caov-3细胞的增殖。 2.不同剂量的棕矢车菊素可以诱导skov3细胞的凋亡。 3.一定剂量的棕矢车菊素能够诱导线粒体膜电位的崩塌。 4.人卵巢癌SKOV3细胞表达PRL-3。 5.不同浓度(0,10,20和40μM)的棕矢车菊素(Jaceosidin)作用于人卵巢癌SKOV3细胞后,其内源性PRL-3的mRNA表达无明显改变。 结论： 1.特定浓度的棕矢车菊素可以抑制卵巢癌细胞的增殖,并经由线粒体途径诱导人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。 2.人卵巢癌SKOV3细胞株均有内源性PRL-3 mRNA的表达。 3.棕矢车菊素在不同浓度下均对入卵巢癌SKOV3细胞内源性PRL-3的mRNA表达无影响。 第三部分喷他脒对卵巢癌SKOV3细胞及其裸鼠移植瘤PRL-3的抑制作用 目的： 探讨喷他脒(Pentamidine)对卵巢癌SKOV3细胞及其裸鼠移植瘤PRL-3的抑制作用。 方法： 应用M TT法检测不同浓度(0.10μmol/L、1.00μmol/L、10.00μmol/L、100.00μmol/L)喷他脒对skov3细胞的生长抑制作用,Westernblot法检测不同浓度喷他脒处理后的skov3细胞PRL-3的表达。,建立人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠转移瘤模型,按喷他脒给药剂量10mg/kg; 5mg/kg; 2.5mg/kg分4组,每组8只,以PBS水溶液组为对照组。观察并记录各组裸鼠及其皮下移植瘤的生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率。采用RT-PCR方法检测裸鼠移植肿瘤的PRL-3表达情况。 结果： 1.在特定的剂量下,喷他脒抑制卵巢癌细胞的增殖。 2.在特定的剂量下,喷他脒抑制卵巢癌细胞PRL-3的表达。 3.实验期间,所有实验用裸鼠均饮食正常,没有一只死亡。治疗前后裸鼠体重没有明显改变。 4.喷他脒中高剂量组(5mg/kg; 10mg/kg)于5次给药后裸鼠移植瘤生长速度均与对照组有差异,抑瘤较大的喷他脒中\高剂量组裸鼠在20天后皮下移植肿瘤生长明显慢于前两组,并具有显著性意义。 5.小剂量喷他眯组抑瘤率为11.1%,中剂量组抑瘤率为33.3%,高剂量组抑瘤率最高,为55.6%,与对照组比较均有统计学意义。 6.中、高剂量喷他脒对人SKOV3卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤的PRL-3表达均有显著影响,可以抑制PRL-3的表达,且随剂量增加而抑制作用更明显。 结论： 1.喷他脒对卵巢癌skov3细胞体外生长及裸鼠SKOV3皮下移植瘤均有有抑制作用。 2.喷他脒可抑制SKOV3卵巢癌细胞及裸鼠SKOV3皮下移植瘤PRL-3的表达。 3.高中低三种喷他脒给药剂量对接种人SKOV3卵巢癌细胞的裸鼠无明显毒性作用。