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蛋白质组学在多发性硬化与视神经脊髓炎血清和脑脊液中的研究

姜寿峰  
【摘要】:研究背景: 多发性硬化(Multiple sclerosis, MS)及视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica, NMO)均是病因不明的中枢神经系统免疫性脱髓鞘疾病,病理过程主要是脱髓鞘改变,临床表现依中枢神经系统累及的部位不同而呈现多样化。 多发性硬化及视神经脊髓炎虽同属中枢神经系统脱髓鞘病,但两者在发病机制、病理表现、临床特点、治疗方案等方面有诸多不同,尤其是在NMO患者血清中发现自身抗体NMO-IgG后,目前更倾向NMO并非是MS的一种亚型而是一个独立的疾病。但由于中枢神经系统组织标本的不易获取,阻碍了对MS及NMO病理机制的进一步研究,而体液作为内环境的重要组成部分,其所含有的多肽、蛋白质和酶类在生理过程中起到非常重要的作用,其蛋白与多肽的质和量的变化,能精确反映机体疾病状态下的病理生理过程,MS及NMO复杂的免疫应答引起脑脊液、血清、脑组织、各种亚细胞器中蛋白质种类和数量的动态变化。鉴于此,可以通过研究MS和NMO血清及脑脊液中特定蛋白的变化,获得反应疾病的发生、进展、以及机体对疾病产生的代偿机制如神经保护、组织重塑、炎症反应等信息。 蛋白质组(Proteome)概念的内容主要包括对全蛋白质的定性、定量和从功能角度分析大量蛋白质,这是一个整体的、动态的概念。蛋白质组学(Proteomics)是指根据蛋白质种类、数量、局部存在的时间、空间上的变化来研究表达于细胞、组织及个体中的全部蛋白质(proteome),并从其结构和功能的角度综合分析生命活动的一门科学。蛋白质组学研究最显著的特点是能对生理与病理状态下的体液、组织或细胞中蛋白质组分进行大通量的综合分析,这有助于对复杂多变的神经系统疾病进行较为全面的认识。 本实验即对MS及NMO患者的血清和脑脊液进行蛋白质组学研究,进行蛋白分离、蛋白鉴定,分析探讨MS、NMO各自的血清和脑脊液蛋白组学特点以及行两者之间的比较研究,以期深入探讨两者的病理机制,并对MS、NMO的诊断及两者的鉴别诊断提供一定的辅助依据。 第一部分MS患者血清和脑脊液的蛋白质组学研究 目的: 建立MS血清和脑脊液2D电泳图谱,分别观察MS与正常对照组血清和脑脊液2D电泳的表达差异;对差异表达的蛋白进行鉴定,并探讨其意义。 方法: 1.采集MS组和正常对照组血清和脑脊液,进行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。 2.分别将血清和脑脊液样品均等份混合后重复跑2D电泳三遍,第一向为等电凝聚凝胶电泳,第二向为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3.硝酸银染法染后,并应用ImageMaster 2D Platinum5.0软件对图像进行分析。 4.分别比较血清和脑脊液结果,选择两组间感兴趣的蛋白点(两组2D电泳图谱中点体积百分比差异两倍以上或者具有有无差异的点)切胶取样、酶解消化,以高敏度HD-ms/ms质谱分析进行蛋白鉴定。 5.利用MASCOT在线软件进行检索蛋白质。 结果: (一)血清结果 1.MS组血清2D电泳凝胶图谱共获得414个蛋白点,正常对照组血清2D电泳凝胶图谱共获得476个蛋白点。 2.MS组与正常对照组血清2D电泳凝胶图谱相比,匹配蛋白点为345个MS组相比正常组表达上调的蛋白点159个,其中上调差异大于2倍以上的蛋白点42个,表达下调的蛋白点186个。两组未匹配的蛋白点,MS组69个,正常对照组131个。 3.MS组血清2D电泳凝胶图谱与正常对照组相比未表达的蛋白点共81个 4.通过HD-ms/ms质谱分析和MASCOT网络检索,鉴定两个差异蛋白质:免疫球蛋白λ和角蛋白83,前者仅见于多发性硬化血清2D凝胶图谱,后者在MS组中的表达比正常对照组差异远大于2倍。 (二)脑脊液结果 1.MS组CSF 2D电泳凝胶图谱共获得118个蛋白点,正常对照组CSF的2D电泳凝胶图谱共获得350个蛋白点。 2.MS组与正常对照组CSF 2D电泳凝胶图谱相比,匹配蛋白点为51个,MS组相比正常组表达上调的蛋白点38个,其中上调差异大于2倍以上的蛋白点24个,表达下调的蛋白点13个。两组未匹配的蛋白点,MS组67个,正常对照组299个。 3.通过HD-ms/ms质谱分析和MASCOT网络检索,鉴定三个差异蛋白质:前白蛋白、角蛋白1和角蛋白9,前白蛋白仅见于多发性硬化CSF的2D凝胶图谱,角蛋白1在MS组无表达而在正常对照组有表达,角蛋白9在MS组中的表达比正常对照组差异远大于2倍。 结论: 1.多发性硬化患者与正常对照组血清2D凝胶电泳图谱对比有多种蛋白质表达呈显著差异。 2.鉴定了两个血清差异表达蛋白免疫球蛋白λ(Ig lamda chain)和角蛋白83(keratin 83)。免疫球蛋白λ高表达可能与MS的免疫机制相关。 3.发性硬化患者与正常对照组CSF的2D凝胶电泳图谱对比有多种蛋白质表达呈显著差异。 4.鉴定了三个脑脊液差异表达蛋白前白蛋白、角蛋白1和角蛋白9。 第二部分NMO患者血清和脑脊液的蛋白质组学研究 目的: 建立NMO血清和脑脊液2D电泳图谱,分别观察NMO与正常对照组血清和脑脊液2D电泳的表达差异;对差异表达的蛋白进行鉴定,并探讨其意义。 方法: 1.采集NMO组和正常对照组血清和脑脊液,进行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。 2.分别将血清和脑脊液样品均等份混合后重复跑2D电泳三遍,第一向为等电凝聚凝胶电泳,第二向为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3.硝酸银染法染后,并应用ImageMaster 2D Platinum5.0软件对图像进行分析。 4.分别比较血清和脑脊液结果,选择两组间感兴趣的蛋白点(两组2D电泳图谱中点体积百分比差异两倍以上或者具有有无差异的点)切胶取样、酶解消化,以高敏度HD-ms/ms质谱分析进行蛋白鉴定。 5.利用MASCOT在线软件进行检索蛋白质。 结果: (一)血清结果 1.NMO组血清2D电泳凝胶图谱共获得472个蛋白点,正常对照组血清2D电泳凝胶图谱共获得476个蛋白点。 2.NMO组与正常对照组血清2D电泳凝胶图谱相比,匹配蛋白点为374个NMO组相比正常组表达上调的蛋白点175个,其中上调差异大于2倍以上的蛋白点57个,表达下调的蛋白点199个。两组未匹配的蛋白点,NMO组98个,正常对照组102个。 3.NMO组血清2D电泳凝胶图谱与正常对照组相比未表达的蛋白点共52个 4.通过HD-ms/ms质谱分析和MASCOT网络检索,鉴定一个差异蛋白质:触珠蛋白Hp2,在NMO组中的表达比正常对照组差异远大于2倍。 (二)脑脊液结果 1.NMO组CSF 2D电泳凝胶图谱共获得155个蛋白点,正常对照组CSF 2D电泳凝胶图谱共获得350个蛋白点。 2.NMO组与正常对照组CSF 2D电泳凝胶图谱相比,匹配蛋白点为82个NMO组相比正常组表达上调的蛋白点64个,其中上调差异大于2倍以上的蛋白点47个,表达下调的蛋白点18个。两组未匹配的蛋白点,NMO组73个,正常对照组268个。 3.通过HD-ms/ms质谱分析和MASCOT网络检索,鉴定三个差异蛋白质:角蛋白1、角蛋白9和转铁蛋白,三者在NMO组中的表达均比正常对照组差异远大于2倍。 结论: 1.NMO患者与正常对照组血清2D凝胶电泳图谱对比有多种蛋白质表达呈显著差异。 2.鉴定了一个血清差异表达蛋白为触珠蛋白。触珠蛋白的高表达提示其在NMO免疫反应中可能发挥一定免疫调节作用。 3.NMO患者与正常对照组CSF的2D电泳图谱对比有多种蛋白质表达呈显著差异。 4.鉴定了三个脑脊液差异表达蛋白细胞转铁蛋白、角蛋白9、角蛋白1。 5.转铁蛋白的脑脊液高表达可能与NMO患者血脑屏障受损相关,可能是NMO病理过程中BBB受损严重的一个反应指标。 第三部分MS与NMO患者血清和脑脊液的蛋白质组学研究 目的: 分别比较MS与NMO患者血清和脑脊液2D电泳的表达差异;对差异表达的蛋白进行鉴定,并探讨其意义。 方法: 1.采集MS组与NMO组血清和脑脊液,进行全蛋白提取、Bradford (?)去蛋白定量。 2.分别将血清和脑脊液样品均等份混合后重复跑2D电泳三遍,第一向为等电凝聚凝胶电泳,第二向为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3.硝酸银染法染后,并应用ImageMaster 2D Platinum5.0软件对图像进行分析。 4.分别比较血清和脑脊液结果,选择两组间感兴趣的蛋白点(两组2D电泳图谱中点体积百分比差异两倍以上或者具有有无差异的点)切胶取样、酶解消化,以高敏度HD-ms/ms质谱分析进行蛋白鉴定。 5.利用MASCOT在线软件进行检索蛋白质。 结果: (一)血清结果 1.MS组血清2D电泳凝胶图谱共获得414个蛋白点,NMO组血清2D电泳凝胶图谱共获得472个蛋白点。 2.正常组血清有表达且同时在MS组血清有表达而在NMO组血清无表达的蛋白点为52个,正常组血清有表达且同时在NMO组血清有表达而在MS组血清无表达的蛋白点为81个 3.通过HD-ms/ms质谱分析和MASCOT网络检索,鉴定二个差异蛋白质:角蛋白83和触珠蛋白Hp2。角蛋白83和触珠蛋白Hp2,两者在MS组和NMO组中均有表达,前者在MS组血清中与NMO组相比表达远大于2倍,后者在NMO组血清中与MS组表达远大于2倍。 (二)脑脊液结果 1.MS组CSF 2D电泳凝胶图谱共获得118个蛋白点,NMO组CSF 2D电泳凝胶图谱共获得155个蛋白点。 2.正常组CSF有表达且同时在NMO组CSF有表达而在MS组CSF无表达的蛋白点为45个,正常组CSF有表达且同时在NMO组CSF无表达而在MS组CSF有表达的蛋白点为14个。 3.通过HD-ms/ms质谱分析和MASCOT网络检索,鉴定二个差异蛋白质:前白蛋白和角蛋白1,前白蛋白在MS组CSF中有表达而在NMO组和正常对照组CSF中无表达;角蛋白1在NMO组CSF中有表达而在MS组CSF中无表达。 结论: 1.MS患者与NMO患者血清、CSF的2D电泳图谱对比有多种蛋白质表达呈显著差异。 2.鉴定了四个差异表达蛋白细胞角蛋白83、触珠蛋白Hp2、前白蛋白及角蛋白1,前两者为血清差异表达蛋白,后两者为CSF差异表达蛋白。


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