大鼠骨髓间充质干细胞影响心脏成纤维细胞合成基质金属蛋白酶及其相关机制研究

【摘要】：实验背景： 心肌梗死(myocardial infarction, MI)后继发心肌细胞代偿性肥大、细胞坏死或凋亡以及细胞外基质成分改变,心室大小、形状、室壁厚度和组织结构等产生一系列变化,这一病变修复和心室整体代偿及继发的病理生理反应过程称为心室重构。MI后心室重构常常导致心脏舒缩功能障碍、心律失常等,是引起心力衰竭的主要原因。目前充血性心力衰竭发病串逐年升高,为目前全球范围内致死和致残的主要疾病之一 近年来药物治疗和介入治疗得到了快速发展,缺血性心肌病患者的预后有了明显的改善,但药物治疗和介入治疗终归不能修复坏死的心肌。随着对干细胞(slem cells)研究的不断加深,认为干细胞具有组织再生的功能,在体内能分化成为其他成熟细胞。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新能力和横向分化能力,移植到心梗局部后能够分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞和心肌细胞样细胞,促进新生血管的形成。大量的研究,包括基础研究和临床前期研究发现MSCs能够挽救濒死的心肌,减少心梗面积,改善心室重构进而提高心功能。然而MSCs如何改善心梗后心室重构的分子机制尚不明确。 以往有研究显示移植后MSCs通过降低心肌组织中基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)的合成和活性来改善心室重构。MMPs是一组能特异的降解细胞外基质成分的酶家族,能使胶原纤维降解增加,心肌胶原结构受到破坏,使左室的大小和形状发生改变,最终影响心肌的收缩力。基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)是MMPs特异性的内源性抑制剂。而心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)是心脏中分泌和合成MMPs和TIMPs的主要细胞。因此,我们推测,MSCs可能通过旁分泌作用影响CFs合成和分泌MMPs,从而起到改善心室重构的作用。 实验目的： 研究体外MSCs能否通过旁分泌作用影响CFs的MMPs的合成,并对可能的作用机制进行探讨。 实验方法： 体外模拟心肌梗死,建立缺氧模型,CFs分为正常对照组(CFs),缺氧组(H-CFs), MSCs共培养组(H-CFs-MSCs)以及缺氧预处理MSCs共培养组(H-CFs-HMSCs)共四组。应用明胶酶谱的方法检测四组MMP-2及MMP-9的活性变化。Western-blot检测MSCs与H-CFs共培养后,能否减弱H-CFs的MMP-2、MMP-9、MT1-MMP (membrane type 1-MMP)及TIMP-1的合成。在MSCs(或H-MSCs)和H-CFs的共培养基中加入促红细胞生成素可溶性受体(erythropoietin soluble receptor, EPOsR)或者促红细胞生成素中和性抗体(erythropoietin neutralizing antibody, EPOAb),再次采用明胶酶谱以及Western-blot方法检测上述指标变化。我们进一步采用Western-blot检测了与MMPs的合成、缺氧以及EPO密切相关的信号通路ERK1/2和AKT的变化。 实验结果： 明胶酶谱结果显示,CFs缺氧24小时处理后(H-CFs)分泌的MMP-2活性比CFs的明显增高；H-CFs分别与MSCs和HMSCs共培养后(H-CFs-MSCs, H-CFs-HMSCs), MMP-2的活性又降低；而MMP-9在CFs、H-CFs、H-CFs-MSCs和H-CFs-HMSCs四组中均没有明显变化。Western-blot结果显示H-CFs中MMP-2蛋白表达较CFs明显增高(P0.01),共培养组H-CFs-MSCs及H-CFs-HMSCs的MMP-2的表达又下降。MT-1MMP在MMP-2的激活过程中起着协同作用,因此我们也检测了MT1-MMP的表达,发现MT1-MMP的变化与MMP-2的变化一致。H-CFs中的TIMP-1蛋白水平比CFs的明显降低,共培养组H-CFs-MSCs及H-CFs-HMSCs中的TIMP-1表达又增加。与明胶酶谱的结果一致,在MMP-9在CFs、H-CFs、H-CFs-MSCs和H-CFs-HMSCs四组中均没有明显变化。在共培养基中加入EPOsR或者EPOAb,均能逆转MSCs和HMSCs对H-CFs合成MMPs的变化。缺氧能够明显增加CFs中的ERK1/2的磷酸化水平,MSCs共培养能够减少ERK1/2的磷酸化表达水平；EPO阻滞剂EPOsR和EPOAb均能逆转MSCs共培养对CFs中磷酸化ERK1/2的影响,而AKT信号通路无明显变化。在我们的研究中,MSCs和HMSCs对CFs合成MMPs的影响无明显区别。 实验结论： 1、MSCs能通过旁分泌作用减少缺氧后CFs的MMP-2、MT1-MMP的表达,增加TIMP-1表达。 2、EPO在MSCs对CFs合成MMP和TIMP-1的旁分泌作用中是一个关键的细胞因子。 3、ERK1/2信号通路在MSCs影响CFs的MMP和TIMP-1的合成中发挥了重要作用。