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酶解虾壳蛋白制备ACE抑制肽及抗氧化肽

施旭丹  
【摘要】:随着我国水产养殖业的迅猛发展,到2010年,我国对虾总产量已突破350万吨。虾壳作为虾仁加工副产品被大量剩下,若不及时处理,会造成环境污染,同时也是资源的一种浪费。通过提取虾壳中蛋白质并对其功能性质进行研究,利用蛋白酶酶解虾壳制备ACE抑制肽和抗氧化肽,为虾壳蛋白作为食品添加剂和功能性食品提供了理论依据,为提高虾壳加工附加值提供思路。具体研究内容如下: 虾壳中组成成分:水分10.95%、粗脂肪11.59%、粗蛋白41.37%、灰分21.26%、甲壳素17.91%。虾壳中蛋白含量较高且脂肪含量低,且通过氨基酸分析,虾壳中氨基酸含量丰富,疏水性氨基酸含量占总氨基酸的25.89%,具备制备ACE抑制肽和抗氧化肽的基本条件。利用碱提酸沉法从虾壳中提取蛋白质,对于其溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和密度等功能性质进行研究。采用Osborne法分级制备虾壳蛋白,虾壳中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白比例为15:2:1:7。通过SDS-PAGE电泳分析,虾壳中主要蛋白分子量为13804Da。 本文对ACE抑制肽构效进行分析,通过现有已发表的ACE抑制肽的部分参数进行数据整合处理,从中找出影响ACE抑制肽活性的有效因素,并揭示其与ACE抑制活性之间关系,为ACE抑制肽酶解和合成提供理论参考。当氨基酸残基较少时,ACE抑制肽具有较高活性。ACE抑制肽活性与残基个数和平均疏水性非常显著相关,与C端的疏水性显著相关。将上述3个参数进行主成分分析,主成分Ⅰ和主成分Ⅱ能够描述所选指标91.65%,并且其与ACE抑制活性关系明确,呈正相关,相关系数为0.3462。 本文研究了酶解虾壳蛋白制备ACE抑制肽的工艺。以虾壳蛋白为原料,选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对其进行水解。以单酶水解产物ACE抑制率和水解度为评价指标,确定了中性蛋白酶和碱性蛋白酶为目标酶。通过单因素实验和正交实验,确定了这2种酶的最适水解条件:中性蛋白酶温度50℃、酶用量2000u/g、底物质量浓度2.5g/100mL、pH7、反应时间2h,ACE抑制率为84.04%;碱性蛋白酶温度60℃、酶用量4000u/g、底物质量浓度2.5g/100mL、pH9.5,反应时间2.5h,ACE抑制率为67.70%。酶解产物分别经过了10KDa和5KDa的膜超滤,发现当分子量小于5KDa时有最高的ACE抑制活性。利用凝胶层析分离中性蛋白酶和碱性蛋白酶分子量小于5000Da酶解产物,中性蛋白酶酶解产物分离得到5个峰,前4个峰分子量分别为794.88Da、569.77Da、456.35Da、262Da。碱性蛋白酶酶解产物分离得到3个峰,分子量分别为711.38Da、365.51Da、262Da,因此推断具有强ACE抑制活性肽为含有2-6个氨基酸短肽。 在本研究中首次对虾壳蛋白酶解产物的抗氧化活性进行了探索。以虾壳蛋白为原料,选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对其进行水解。以DPPH自由基清除率和FRAP还原能力为评价指标,选择碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶为目标酶,通过单因素实验和正交实验优化酶解工艺,确定酶解条件为:木瓜蛋白酶温度65℃、pH6.5、酶用量2000u/g、反应时间2.5h,DPPH自由基消除率为94%;当碱性蛋白酶底物质量分数温度50℃,pH 10,酶用量3500u/g,底物质量分数为6.5g/100mL,反应时间2.5h,FRAP还原力为1.501mol/mL。


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