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水解进程对乳蛋白酶解产物抗菌性能的影响研究

夏明  
【摘要】:生物活性肽是指对生命活动具有调节作用的多肽,通常以多肽链序列的形式存在于蛋白质之中。利用天然的蛋白质作为原料,使用蛋白酶水解制取各种生物活性肽,是生物活性肽制备技术中最具可行性的一种。使用酶解法制取生物活性肽,有间歇式水解和酶膜生物反应器中连续水解两种手段,前者自动化程度低,操作简便,后者可以连续运行,生产效率高。 抗菌肽是生物活性肽家族中的一员,它是生物体抵抗外来微生物侵袭的重要手段,通过破坏细胞膜结构、诱导细胞凋亡、抑制细胞呼吸和DNA合成等机制来达到抑菌作用。从制备抗菌肽的天然蛋白质的来源上讲,乳蛋白是制备抗菌肽的重要原料。乳蛋白中的乳酪蛋白、乳清蛋白和乳铁蛋白,它们的水解产物对微生物的影响存在差异。本论文的研究,主要分为以下几个部分:第一是探索了乳蛋白的分离与检测技术,优化分离工艺,提出了新的乳铁蛋白的检测方法;第二是在间歇式反应条件下,对不同类型的乳蛋白进行酶解,优化酶解反应条件,测定水解产物的抗菌特性;第三是尝试在酶膜反应器中连续水解乳蛋白制备抗菌肽。 论文首先以脱脂乳粉作为原料,通过控制等电点的手段制备酪蛋白,得率可以达到7.8%。除去酪蛋白后的乳清,在中性条件下经过10K的超滤膜处理,可以脱去其中的乳糖和盐分,成为高纯度的乳清分离蛋白。 论文提出了一种借助高效液相色谱测定乳制品中乳铁蛋白的方法。先通过额外加入的亚铁离子使乳铁蛋白的构型更加稳定。然后用60%乙醇沉淀蛋白除去糖分,再用醋酸盐缓冲液提取乳铁蛋白并分离掉酪蛋白,最后用高效液相色谱检测。采用LiChrosorb RP-C18色谱柱,在0.1%三氟乙酸协助下,甲醇与水线性梯度洗脱。乳铁蛋白的线性范围是0.4~2mg/mL (R2= 0.9980),平均回收率95.4%。可以用于一般乳制品中乳铁蛋白的测定。 此外,一种借助乳铁蛋白铁结合能力测定奶粉中乳铁蛋白的方法也被提出并与HPLC的检测结果进行比较。先通过额外加入的亚铁离子使乳铁蛋白中的铁达到饱和以获得稳定的铁含量,然后对蛋白反复醇沉和水溶以除去游离铁,再用原子吸收分光光度计测定铁含量,依据铁与蛋白含量的相互关系计算出乳铁蛋白含量。该法快速准确,加样回收率超过96%,检测范围为3.5-100mg/g。该法可以用于婴儿配方奶粉中乳铁蛋白的测定。 以牛初乳作为原料,经等电点沉淀和加压过滤除去酪蛋白,随后在pH 7.5条件下加入乙醇至50%,可以使乳清中的乳铁蛋白沉淀并获得粗制品,粗制品经低压液相色谱纯化以及切向流超滤脱盐后可以获得高纯度的乳铁蛋白,该乳铁蛋白制品经HPLC和HPEC分析,杂质含量均已低于检测限度。 在乳铁蛋白水解工艺的优化过程中,使用平行试验法设计实验,借助Mathematic7.01软件实施曲面回归分析初步得出,当以蛋白质水解程度最大为目标时,胃蛋白酶水解乳铁蛋白反应体系适宜的条件是:底物浓度2%,温度37℃,pH 2.2-2.3,酶用量7U/g。当水解反应进行到60min时,所得水解产物抑菌活力最强。 在乳清蛋白水解工艺的优化过程中,使用SPSS 18.0软件设计正交实验方案,并进行单变量一般线性模型的方差分析。使用碱性蛋白酶水解乳清蛋白适宜的工艺参数为:酶底比5%,pH8.0,温度45℃。水解产物不对病原微生物产生抑制作用,但可以促进益生菌的生长。 将胰蛋白酶和中性蛋白酶以1:1的比例复合使用来水解酪蛋白。使用Design Expert软件的Box-Behken模块中的响应面分析法设计实验方案并作回归分析,发现在pH7.4,温度44℃,底物浓度32g/L,酶底比2.5%下,水解90min后,水解度可以达到15%,此时水解多肽产物抵抗病原微生物的活力达到最强,该水解多肽同时又能促进益生菌的生长。 本文使用了自制酶膜生物反应器连续水解乳铁蛋白制备乳铁素。使用截留分子量为10k的聚醚砜超滤膜作为试验用膜堆。发现只要控制好底物流加速率并在线添加酶活,酶膜生物反应器就可以实现稳定产出。在酶膜生物反应器中乳铁蛋白的转化率和乳铁素的得率较间歇式反应有明显提高。


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