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仔猪断奶腹泻性大肠杆菌的多重耐药性、毒力因子分布及特异性蛋黄抗体药效的研究

姜中其  
【摘要】:仔猪断奶腹泻(post-weaning diarrhea, PWD)是危害养猪业的重要疾病,主要表现为腹泻和体重增加减慢,严重时仔猪脱水、酸中毒甚至死亡。PWD是一种多因子参与的复杂病症,但大肠杆菌在一系列复杂的生物学过程中是决定性的环节。在不同国家和地区、不同年代,PWD病原性大肠杆菌毒力因子可有较大差异。准确诊断和辨别粘附素等毒力因子类型是有效免疫防治PWD的前提。分离纯化病原菌毛等毒力因子作为抗原免疫产蛋母鸡防治肠道感染是近年来国外学者研究的热点之一。国内在PWD病原性大肠杆菌多重耐药性、毒力因子流行病学和PWD模型建立及菌毛特异性IgY的药效评价及IgY的合理应用方案等方面的研究方面报道很少。 本研究直肠棉拭采集浙江地区不同规模化猪场仔猪断奶腹泻病料,应用微生物学技术进行细菌分离培养鉴定,并采用大肠杆菌专属引物通过PCR体外扩增确认,进一步通过小鼠致病性试验得到75株病原性大肠杆菌。玻板凝集试验O抗原检测结果表明分离鉴定病原性大肠杆菌O抗原至少覆盖11种血清型,其中0149、0139、08为优势血清型。 采用WHO推荐的Kirby-Bauer法,以大肠杆菌ATCC25922为质控菌,以CLSI的临界浓度为判断标准,对分离的病原性大肠杆菌开展常用抗菌药物的耐药性监测,并采用WHONET进行数据分析。结果表明,病原性大肠杆菌耐药性普遍,其中对氯霉素(100.0%)、复方新诺明(86.7%)、多西环素(82.3%)、链霉素(81.8%)的耐药性很高,对羧苄西林、多粘菌素B及庆大霉素、环丙沙星及诺氟沙星的耐药率也较高,其耐药率分别高达69.6%和66.7%、63.6%,56.4%和61.5%。66株大肠杆菌共有36种耐药谱型,绝大多数为多重耐药。对5种抗菌药物耐药的菌株占比例最大(18.18%),其次是对6种抗菌药物耐药(15.15%)和对9种抗菌药物耐药(12.12%)的菌株;链霉素与多类其他抗菌药存在一定的交叉耐药性。不同规模化猪场病原大肠杆菌菌株耐药性存在一定差异。结果提示,浙江地区规模猪场仔猪断奶腹泻大肠杆菌的耐药性以多重耐药为主,且对抗菌药物的耐药现象已相当严重,在临床选用药物进行治疗时,应充分考虑菌株的耐药性问题,以免延误病情造成治疗失败。 采用PCR检测Ⅰ型、Ⅱ型整合酶和耐药基因盒并测序分析。结果表明,Ⅰ型整合酶阳性菌占检测菌株的88.0%(66/75),Ⅱ型整合酶阳性菌占检测菌株的17.3%(13/75)。所有Ⅰ型整合酶阳性菌株均对2种以上抗菌药物耐药,并且检测到Ⅱ型整合酶的菌株中有84.6%(11/13)也检测到Ⅰ型整合酶,提示1株细菌可同时携带多个整合子。Ⅰ型整合酶阳性细菌耐药基因盒检出率为46.7%(35/75),未检测到Ⅱ型整合子基因盒。随机取18株耐药基因盒阳性菌,体外扩增出产物经测序分析,结果表明,250bp、1.1Kb、1.6Kb、1.7Kb和2.0Kb等5种基因盒片段以7种组合方式存在,含有aadA基因和dfrA等耐药基因,分别编码对链霉素和磺胺类药物的耐药性,这与耐药表型检测中分离菌多对这两类药物耐药相符。研究提示,Ⅰ型整合子在介导规模化猪场PWD病原性大肠杆菌多重耐药中有重要作用。 应用菌毛单因子血清对分离菌进行玻板凝集试验和多重PCR技术分析粘附素及肠毒素类型。结果表明,PWD病原性大肠杆菌中产肠毒素大肠杆菌(ETEC)占病原性大肠杆菌分离总数的67.92%(36/53);粘附素F4和F18分别占总检测菌株数的24.53%(13/53)和28.30%(15/53);肠毒素中产STa、STb、STa+STb、LT和SLT-2e分别占总检测菌株数的30.19%(16/53)、35.85%(19/53)、18.9%(10/53)、1.89%(1/53)和9.43%(5/53)。采用PCR对F4、F18亚型的进一步分析表明,大肠杆菌分离株F4ac占76.9%(10/13),F4ab占23.1%(3/10);F18分离株均为F18ac(15/15)。研究表明,浙江地区PWD病原性大肠杆菌以产肠毒素型为主,主要毒力因子包括粘附素F4、F18和肠毒素STa、STb。 以PWD病原性大肠杆菌优势菌F4菌毛蛋白为抗原,辅以弗氏佐剂,制备免疫原免疫产蛋母鸡生产特异性蛋黄抗体。结果表明,加强免疫后3w,弗氏佐剂组卵黄中效价可达4.41g,在弗氏佐剂的辅助下能维持时间长达9w。卵黄中效价稍低于血清,但在高水平维持时间较长,而PBS组无论卵黄中还是血清中抗体效价均低于弗氏佐剂组。研究还表明,以10μg/ml(1ml/只)剂量免疫蛋鸡,足以获得高效价的抗体。进一步采用喷雾干燥、冷冻干燥和沸腾干燥等方法成功制备高免全蛋粉,经小白鼠急性毒性试验表明属实际无毒物质。体外抑菌试验表明,抗体效价≥1:3000时,IgY能在37℃条件下8h内完全抑制F4+ETEC(菌液浓度为104cfu/ml)的生长繁殖。 采用杜长大三元杂交断奶仔猪,通过经口灌服ETEC临床分离强毒株,诱导仔猪发生腹泻,建立PWD模型,并考察上述方法研制的特异性蛋黄抗体的药效。试验分二批进行。试验一,采用F4+和F18+ETEC混合攻毒,仔猪按体重窝别随机分为①IgY组②(IgY+头孢唑啉+大观霉素)组③阳性对照组。试验二,采用F4+ETEC攻毒。仔猪按体重窝别随机分为①IgY组②大观霉素组③阳性对照组。攻毒后每天采取新鲜粪样用平板菌落计数法测定大肠杆菌数。各样本随机取10个菌落采用三重PCR方法测定攻毒菌的比例。结果表明,混合感染两种ETEC后,第1-6d口服IgY试验组粪便评分(日平均)为0.43,显著(P0.05)低于阳性对照组(1.43)和(IgY+头孢唑啉+大观霉素)组(1.36)。试验二中,F4+ETEC攻毒后第1-6d口服IgY试验组粪便评分(日平均)为0.86,显著(P0.05)低于阳性对照组(1.57)和大观霉素组(1.50):粪便中大肠杆菌总数及攻毒菌的排出量方面,无论是混合感染还是单独感染,IgY组仔猪均低于阳性对照组,且排毒持续时间短。本研究提示,无论标准株还是分离株,F4菌毛均具有良好的免疫原性,结合弗氏佐剂按一定程序免疫母鸡,能诱导产生高效价的抗体且能持续较长时间并转移至蛋黄中。本试验建立的PWD模型操作简便,重复性好,能用于深入研究PWD发生发展机理和评价抗仔猪断奶腹泻的药效。三重PCR具有特异性和较好的灵敏度,能快速检测攻毒菌在肠道的排出动态变化。特异性抗体均能有效地控制腹泻的发生发展,有效口服剂量为每次0.3g/kg.bw,3次/d,连续应用3-5d。宜与抗F18菌毛特异性抗体联合应用,但不宜与抗菌药物合用。 以上结果为深入探索PWD病原性大肠杆菌的致病机理、耐药机理和耐药控制,特异性IgY被动免疫防治PWD的研究奠定了良好基础。


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