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纤维素酶产生菌的筛选及纤维素酶基因在家蚕中的表达研究

李兴华  
【摘要】:纤维素酶催化水解纤维素,它主要包括三个成分:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶。它能使纤维素类生物质转化为葡萄糖,从而在许多不同的领域得到应用,例如燃料乙醇、动物饲料、废水处理及酿酒工业等。通常,其酶活性一般在酸性条件下比较高,在中性或碱性条件下比较低。本研究通过自然筛选获得了产酶特性良好的大肠杆菌新菌种;通过微波与紫外复合诱变获得了产酶能力显著提高且非常稳定的绿色木霉突变株;通过克隆野生型绿色木霉的若干内切葡聚糖酶基因,并在家蚕中获得具有生物活性的表达,为纤维素酶转基因家蚕的构建提供了理论依据;通过纤维素酶转基因载体的构建,为纤维素酶转基因家蚕个体的构建提供了实验基础。主要结果如下: 1.纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及特性分析 在37℃培养条件下,利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂筛选平板,从土壤中筛选到一株纤维素酶产生菌,该菌能够分泌独特的耐热耐碱性的纤维素酶。基于16S rRNA和ITS基因分析,并结合革兰氏染色试验,鉴定该菌为大肠杆菌,其16S rRNA和ITS的基因序列已登录Genbank数据库,登录号分别为FJ823386和FJ823387。测定该菌在含有1% CMC-Na的LB发酵培养基中的CMCase、FPase和β-glucosidase的活性,发现三种酶活性分别在培养时间为72 h,96h和120h时达到最高,数值分别为0.23、0.08和0.15 U/ml(或4.13、0.56和0.50 U/mg总蛋白)。CMCase活性分别在50℃和pH 6.0条件下达到最高,且分别在50~70℃中处理20 min和80℃中处理10 min以后,仍然保持最大活性的60%以上,在90℃中处理10 min后仍然保持最大活性的50%左右。 2.微波与紫外复合诱变提高绿色木霉纤维素酶活性 利用麸皮固体发酵培养基培养并发酵产纤维素酶真菌绿色木霉(Trichoderma viride)。测定绿色木霉在麸皮固体发酵培养条件下的羧甲基纤维素酶(CMCase)特性,即最佳培养时间、最佳pH和最佳反应温度,发现在该固体发酵条件下绿色木霉的最佳培养时间为60 h,最佳pH为5.0,最佳反应温度为50℃。利用CMC-Na和刚果红来筛选具有较强产酶能力的菌株。经微波与紫外的复合诱变后,筛选到7株突变菌株(M-B1至M-B7)并测定其CMCase活性。其中五株突变菌株(M-B1,M-B2,M-B3,M-B5和M-B7)较野生型菌株有显著增强的产酶能力,并且经过9代的繁殖,它们的产酶能力仍非常稳定。分子研究显示,突变体EGⅠ基因的某些碱基存在突变,表明这些突变株纤维素酶生产能力的提高可能与碱基突变造成EGⅠ蛋白的某些氨基酸发生改变有关。 3.绿色木霉内切葡聚糖酶基因的克隆及序列分析 以绿色木霉AS 3.3711的基因组DNA为模板,根据Genbank数据库上的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(EGⅠ, GenBank登录号为AY343986)、内切葡聚糖酶Ⅲ基因(EGⅢ,GenBank登录号为AY343987)、内切葡聚糖酶Ⅳ基因(EGⅣ, GenBank登录号为Y11113)及内切葡聚糖酶V基因(EGⅤ, GenBank登录号为AY343989)的DNA序列,设计用于外显子拼接的特异性引物,用高保真酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase进行PCR扩增及拼接。外显子拼接的PCR产物经末端加A反应后,克隆到T载体中并进行测序。测序结果表明,在核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性这两方面,EGⅠ、EGⅢ和EGⅣ均与上述Genbank数据库中相应的基因达99%,EGⅤ达100%。其中,所克隆的EGⅣ基因可能是绿色木霉AS 3.3711的一个新基因,已登录Genbank数据库,登录号为HM222525。 4.绿色木霉内切葡聚糖酶基因在家蚕中的表达 通过PCR技术扩增内切葡聚糖酶EGⅠ、EGⅢ、EGⅣ和EGⅤ的成熟肽基因序列,并利用最新建立的BmNPV/Bac-to-Bac突变体杆状病毒表达系统(该突变体杆状病毒缺失了家蚕核型多角体病毒编码的几丁质酶和组织蛋白酶基因),在家蚕细胞系和家蚕幼虫中表达了这些重组蛋白酶。在重组病毒mBacmid/BmNPV/EGⅠ、mBacmid/BmNPV/EGⅢ、mBacmid/BmNPV/EGⅣ及mBacmid/BmNPV/EGⅤ感染家蚕BmN细胞后,经western blotting分别检测到约49 kDa、45 kDa、42 kDa及36 kDa的重组蛋白。其中,EGⅠ在家蚕幼虫中表达时,感染时间为84 h时表达量最高,并测定此时的酶活性。其他重组蛋白也均在感染家蚕幼虫84 h时测定其酶活性。方差分析显示,经重组病毒mBacmid/BmNPV/EGⅠ、mBacmid/BmNPV/EGⅢ、mBacmid/BmNPV/EGⅣ及mBacmid/BmNPV/EGⅤ感染的家蚕,其酶活性分别在pH 7.0和50℃、pH 8.0和50℃、pH 6.0和50℃及pH 5.0和50℃条件下,达到显著性的最大值,与野生型突变病毒mBacmid/BmNPV感染的家蚕以及正常培养的家蚕相比,酶活性分别提高了24.71%和22.84%、20.94%和19.13%、48.84%和46.61%及39.86%和37.76%,且分别在pH 5.0-10.0和温度40~60℃之间、pH 5.0~9.0和温度40~60℃之间、pH 5.0~10.0和温度40~60℃之间及pH 5.0~10.0和温度50~60℃之间,酶活性保持稳定。通过家蚕能够获得大量的重组纤维素酶蛋白,可能会极大地促进将来关于纤维素酶的研究及其在工业上的潜在应用。它提供了一种构建表达纤维素酶的转基因家蚕的可能性,该纤维素酶转基因家蚕能够在家蚕消化道中特异性地表达纤维素酶,更有效地促进桑叶饲料的代谢过程,对于养蚕业意义重大。 5.纤维素酶转基因载体的构建及细胞转染 为了构建纤维素酶转基因家蚕,首先需要构建纤维素酶转基因载体。通过设计引物,利用PCR等技术,首先从质粒pigA3-IE-Neo中克隆了IE promoter序列、SV40 polyA序列、GFP序列以及含有IE promoter和SV40 polyA的Neo基因序列,从质粒pMD18-T/EGⅣe中克隆了EGⅣ基因序列,然后拼接合成均含有IE promoter和SV40 polyA的EGⅣ和GFP序列,最后通过酶切连接将均含有IE promoter和SV40 polyA的EGⅣ、GFP和Neo基因分别连入质粒pXL-BacⅡ中,由此获得的重组质粒被命名为pXL/EGⅣ/GFP/Neo。用去内毒素的质粒抽提试剂盒提取重组质粒pXL/EGⅣ/GFP/Neo后,转染家蚕BmN细胞,确认GFP和Neo的表达正常。


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