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竹节人参皂苷对乙醇性肝损伤的保护机理研究

李有贵  
【摘要】:酗酒既是个社会问题也是个医学问题,因酗酒导致的急慢性酒精中毒、酒精性脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化等疾病严重危害着人们的健康。大量饮酒过后,血液中乙醇浓度明显升高,出现各种醉酒症状。乙醇主要在肝脏中通过乙醇氧化系统进行代谢,同时产生大量自由基02-·、OH·,以及乙醇自身产生的自由基C2H50-和C2H5OH-,当产生自由基超出了机体的清除能力,便造成机体组织损伤。所以普遍认为乙醇导致肝损伤,其机制之一是通过激活O2产生自由基,导致肝细胞膜脂质过氧化及肝细胞损伤。 竹节人参(Panax Japonics.C.A.Mey)系五加科植物,为《中华人民共和国药典》收载的名贵常用中药,通常被认为具有抗炎、镇痛、镇静、抗衰老、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤、保护中枢神经系统、保护心血管系统、保护内分泌系统、保护免疫系统等多方面的功能,其主要化学成份为竹节参皂苷。现代药理学研究发现,竹节人参总皂苷可显著提高多种模型(如:运动、衰老、脑缺血再灌注损伤、高脂血症、等)动物血清、肝脏中SOD、CAT、GSH-PX活性,同时降低MDA含量,从而抑制脂质过氧化。因此,本研究利用循环超声波提取了人工栽培的竹节人参总皂苷,高效液相色谱-蒸发光散射检测-质谱(HPLC-ELSD-MS)分析了竹节人参皂苷单体及含量组成,并以抗氧化性为着手点,研究了竹节人参总皂苷对模型小鼠、人胚肝细胞L-O2乙醇性损伤的保护作用及作用机理,同时分析了不同竹节人参皂苷单体对乙醇损伤肝细胞L-O2的保护作用及作用机理,主要研究结果如下: 1、通过竹节人参总皂苷提取,HPLC-ELSD分离获得6个皂苷单体,通过标准品比对,结合HPLC-ESI-MS分析,可知分别为Rg1、Re、Rf、F3、Rg2和Rd,其在人参总皂苷中的含量分别为:12.23%、16.24%、16.95%、7.51%、8.53%和11.47%。 2、给乙醇性肝损伤模型小鼠灌胃给予竹节人参总皂苷,气相色谱法(GC)测定小鼠血清、尿液中乙醇浓度,分光光度法测定小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性以及血清、肝组织中丙二醛(MDA)含量、还原型谷光甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性等生化指标,光镜、透射电镜观察肝组织超微病理变化,研究竹节人参总皂苷对小鼠乙醇性肝损伤的保护效果及作用机制;结果显示,竹节人参总皂苷不具有抑制乙醇在胃肠道吸收作用,但能显著降低乙醇肝损伤模型小鼠血清ALT、AST酶活性及血清、肝组织MDA含量,提高模型小鼠血清、肝脏中GSH含量和抗氧化酶GSH-PX、CAI、SOD的活性。在血清中,竹节人参总皂苷50 mg/kg剂量组小鼠血清GSH含量、GSH-PX、CAT和SOD活性与正常组小鼠无显著性差异(P0.05);在肝脏中,竹节人参总皂苷50 mg/kg剂量组小鼠肝脏GSH-PX、SOD活性可恢复至正常水平,与正常组小鼠无显著性差异(P0.05);GSH、CAT水平虽然显著提高,但仍显著低于正常组(P0.01);竹节人参总皂苷(50 mg/k)可降低肝组织病变,促进肝小叶结构恢复正常,肝索、肝窦无明显异常,肝细胞体积逐渐恢复正常,细胞核染色质分布较均匀,核膜整形光滑,线粒体结构基本恢复正常,内(嵴)外膜完整,基质均匀,但部分线粒体嵴仍有些紊乱。以上结果表明,竹节人参总皂苷具有提高机体抗氧化功能,特别是对肝细胞及细胞器线粒体的结构完整性具有明显的保护作用。 3、通过台盼蓝染色计数观察竹节人参总皂苷对正常及乙醇损伤的肝细胞L-02活性的影响,分光光度法测定肝细胞内液MDA含量和SOD、GSH-PX、CAT活性变化,以及RT-PCR分析肝细胞内SOD1、SOD2、SOD3、GSH-PX1、GSH-PX2、CAT mRNA水平变化,研究竹节人参总皂苷对乙醇损伤人胚肝细胞L-02的保护作用及作用机制。结果发现,对正常肝细胞,竹节人参总皂苷(100μg/mL)表现出明显的促进L-02增殖作用,当竹节人参总皂苷浓度达400μg/mL时,则表现出明显的抑制细胞增殖作用;对乙醇损伤的肝细胞L-02,竹节人参总皂苷(100μg/mL)表现出明显的保护作用,其肝细胞内液MDA含量、SOD、GSH-PX活性可恢复至正常水平(P0.05),CAT活性虽显著升高,但仍显著低于正常组(P0.01)。RT-PCR分析发现,竹节人参总皂苷(100μg/mL)可促进SOD1、SOD2、SOD3、GSH-PX1、GSH-PX2、CAT mRNA表达,其中GSH-PX3显著高于正常组(P0.01),SOD1、SOD3与正常组无显著差异(P0.05),SOD2、CAT虽显著提高,但仍低于正常对照(P0.01),该结果与体内实验结果一致,说明竹节人参总皂苷发挥抗氧化作用与促进抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT特别是SOD1、SOD3、GSH-PX3mRNA表达有关。 4、通过清除羟自由基(OH·)和超氧阴离子自由基(02·)试验,进行竹节人参总皂苷体外抗氧化能力评价。结果竹节人参总皂苷呈现出明显的清除OH·效应,并且其效果优于Vc,当浓度为12.5-1600μg/mL时,竹节人参总皂苷和Vc对OH·清除率分别为3.37-59.47%和3.10-31.79%;竹节人参总皂苷对联苯三酚自氧化具有一定的抑制作用,能清除O2-·,但清除能力要低于Vc,当浓度为12.5-1600μg/mL时,竹节人参总皂苷和Vc清除率分别为1.01-6.87%和0.89-15.98%。研究结果表明,竹节人参总皂苷在乙醇性肝损伤保护作用中,不仅可提高抗氧化剂GSH含量以及抗氧化酶GSH-PX、CAT、SOD的活性,同时具有直接清除肝代谢过程产生的·OH、O2-·自由基,亦或者是两者的协同作用达到对肝细胞的保护。 5、通过MTT法测定细胞存活率,分光光度法测定肝细胞内液MDA含量、SOD及GSH-PX活性,研究竹节人参皂苷单体对乙醇损伤肝细胞L-02的保护作用及作用机理。结果显示,Rg1 0.16 mg/mL、Re 1.28 mg/mL和Rf 0.64mg/mL可促进正常肝细胞L-O2增殖,增殖率分别为22.68%、34.80%和28.47%(P0.01);Rd 0.16mg/mL和F3 1.28 mg/mL对正常肝细胞L-O2生长表现出明显的抑制作用,抑制率分别为49.69%和43.33%(P0.01)。对乙醇损伤的肝细胞L-O2,Rg1 0.16mg/mL、Re 1.28 mg/mL和Rf 0.64 mg/mL具有明显的保护作用,对细胞生长的抑制率由乙醇损伤模型组的50.37%分别降低为23.31%、26.90%和26.58%(P0.01);Rd 0.16mg/mL和F3 1.28 mg/mL则加剧乙醇对肝细胞的损伤,抑制率高达83.18%和64.79%(P0.01)。乙醇损伤模型组肝细胞L-02内乙醇代谢产生MDA含量、抗氧化酶SOD和GSH-PX活性分别为1.35±0.05μmol/mL、26.45±2.78 U/mL和67.04±4.27U/mL, Rg1 0.16 mg/mL、Re 1.28 mg/mL和Rf 0.64mg/mL可降低乙醇损伤的肝细胞L-02内MDA含量,分别降低为1.17±0.04、1.21±0.03和1.21±0.05μmol/mL(P0.01);提高SOD活性,分别升高为38.32士4.85、35.58±4.43和38.96±3.27 U/mL(P0.01);增强GSH-PX活性,分别升高为86.30±5.72、78.40±3.54和84.25士4.35U/mL(P0.01)。以上结果表明,人参皂苷单体Rg1、Re和Rf对乙醇损伤肝细胞L-02具有明显的保护作用,清除乙醇代谢过程中产生的MDA以及提高抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性,可能是其发挥该保护作用的机制之一。


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