红腹锦鸡SSR和Ⅱ类MHC位点的分离及种群遗传结构分析

【摘要】：红腹锦鸡(Chrysolophus pictus)隶属鸡形目(Galliforme)雉科(Phasianidae)锦鸡属(Chrysolophus),是我国特有的国家Ⅱ级濒危野生动物。 多年来,生境破坏和过度猎杀,导致红腹锦鸡的栖息地严重片段化。本论文以生境片段化为切入点,并在分离SSR和Ⅱ类MHC位点以及建立两套分子标记系统的基础上,通过群体检测,探索生境片段化对种群遗传结构的影响,以及种群在片段化胁迫下的环境适应性等科学问题。 首先,利用磁珠富集方法共分离获得了14个红腹锦鸡特异的多态性SSR位点,并以此建立了物种的SSR分子标记系统。进一步地,运用SSR对红腹锦鸡野外现有的13个片段化种群进行群体检测,得到191个等位基因,其观察杂合度在0.358到0.930之间。通过STRUCTURE软件分析,发现13个种群被分为四大区域{四川(剑阁、青川、利川)；中部(黔江、湖南、贵州)；秦岭(佛坪、石印沟)；北部(龙草坪、宁陕、临夏、宝鸡、天水)｝(分组A)。通过AMOVA验证了这四大区域之间存在显著的遗传变异(FCTFSC,P0.001)。利用SSR数据生成的Nei氏标准遗传距离和余弦距离构建了种群地理系统树,该结果证明各地理种群之间的关系和STRUCTURE分析结果非常吻合。 与此同时,以红腹锦鸡为对象,首次建立了适于鸟类基因组BAC文库构建的"Reverse-4D"新方法。‘'Reverse-4D"方法简便,省时且节俭经费,用之构建一个鸟类的基因组BAC文库,仅需传统“4D”方法的1/10左右的时间。特别地,筛选一个100-160kb的大片段DNA,则仅需传统BAC文库筛选方法的1%左右的工作量,达到了快速、高效和便捷的目的。 运用"Reverse-4D"方法在成功构建红腹锦鸡基因组的"Reverse-4D" BAC文库的基础上,筛选得到7个MHC质粒。在S2质粒中包含20个基因,部分的BG基因、3个Blec基因、3个ⅡB基因、TAPBP基因、BRD2基因、DMA基因、2个DMB基因、2个MHC IA基因、TAP1基因、TAP2基因、C4基因、CenpA基因、CYP21基因和部分的TNXB基因。通过Chpi-MHC分析,发现红腹锦鸡和原鸡之间的基因相似度和基因排布顺序非常的相近,除了两个特殊的地方外,基本上呈现线性的同源性。主要的差异表现在红腹锦鸡有3个MHCⅡB基因,3个Blec基因,而原鸡只有2个MHCⅡB基因及2个Blec基因,说明在MHC家族中存在基因重复事件。另外在TAPBP基因和TAP1-TAP2区域,发生了基因的翻转过程。 在红腹锦鸡MHC基因结构的基础上,随后成功建立起物种的MHCⅡB基因位点特异性扩增系统。通过PCR-SSCP在三个位点中分别得到18个、7个和7个等位基因,分析表明在ⅡB基因中存在正向选择、协同进化和跨物种进化现象。通过参照相近物种设计引物扩增ⅡA部分,种群研究调查显示其为单态。进一步地,通过MHCⅡB群体调查研究,发现不同种群之间等位基因频率存在很大的差别；其中ⅡB1*01、ⅡB2*01和ⅡB3*02分别是三个位点中的出现频率最高的等位基因。利用STRUCTURE软件对MHC数据进行分析,发现13个种群被分为两大区域{(剑阁、青川、佛坪、石印沟、龙草坪、宁陕、临夏、宝鸡、天水),(利川、黔江、湖南、贵州)}(分组B)；并且通过AMOVA验证了这两大区域之间存在显著的遗传变异(FCTFSC,P0.001)。 通过SSR和MHCⅡB两种分子标记相比较,得到SRTUCTURE分组情况不同的现象,其中利川种群可能由于环境选择的压力,和湖南、黔江、贵州种群区域较为接近；而分组A中的另外9个种群在分组B中则聚集到一簇(均位于长江以北),说明这些种群之间存在同质化。因此认为长江这一地理结构对该物种的MHC基因进化存在一定的影响。通过G'st来比较MHC和SSR的遗传分化,发现G'st-MHC低于G'st-SSR,并且位于其95%置信区间之外G'st-SSR/G'st-MHC平均值的比值为2.036,说明在该物种中平衡选择对于MHC基因家族的选择起了重要的作用。 综上所述,对于保护的建议措施如下：按照MHC的分析结果将其分布划分为两个大区域,在地理结构上为长江所间隔,因此对于江北和江南地区的种群可以适当进行种群引进,提高物种的遗传多样性；佛坪和利川种群具有较为独特的MHC结构,在该物种的抗病研究上是一个很好的试验对象,后期可以进行关于病原体如何导致MHC选择的相关研究。