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家蚕表达的绿色荧光蛋白标记的霍乱毒素B亚基与人胰岛素融合蛋白抗1型糖尿病的研究

孟巧红  
【摘要】:1型糖尿病(type1diabetes,T1D)是一种针对胰腺胰岛p细胞的自身免疫性疫病,其结果是导致胰岛素分泌缺乏。自身反应性抗体和T淋巴细胞的出现、T细胞介导的疾病过继转移性以及对免疫抑制治疗的敏感性是T1D自身免疫性的集中表现。在该疾病的发生过程中,胰岛素(insulin, Ins)、胰岛素其前体、谷氨酸脱羧酶等是其主要自身抗原。 1口服家蚕表达的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit, CTB)与人胰岛素融合蛋白治疗1型糖尿病的研究 口服一种疾病特异的自身抗原可诱导机体对该疾病产生免疫反应的耐受,从而抑制或延缓该自身免疫性疾病的发展。在机体内有效诱导免疫耐受需要长期的口服大剂量的特异蛋白抗原,而CTB是诱导口服免疫耐受的强有力的粘膜佐剂分子,可开发用来偶联抗原蛋白大大减少抗原蛋白的口服耐受诱导使用剂量,提示CTB偶联自身抗原Ins诱导口服耐受防治T1D可能具有实际的治疗意义和潜在的应用前景。 在本研究中我们构建了GFP标记的CTB与人Ins融合基因,并利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达该蛋白,该融合蛋白(48kDa)在家蚕幼虫的血淋巴中表达量达到0.58mg/ml。经验证,该融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在,并且保持与神经节苷脂GM1的结合特性以及CTB和Ins的抗原性。非肥胖性糖尿病(non-obese diabetes,NOD)小鼠口服微克级的含此融合蛋白的蚕血淋巴,胰腺的组织病理切片显示胰岛发炎程度显著减轻,适时监测血糖的实验结果亦表明T1D的发病明显延缓。这些结果表明家蚕生物反应器是一个理想的口服疫苗生产体系,并且口服通过该生产体系表达的蛋白可诱导对T细胞介导的某些自身免疫疾病的耐受,在该方向上的科学研究利用我国自身蚕业资源的优势探索T1D的口服治疗疫苗,为T1D的治疗提供了新的切入点。 2.口服胰岛素治疗T1D的作用机制与特异性调节性T (regulatory T, Treg)细胞的相关性研究 粘膜诱导的免疫耐受在治疗自身免疫性疾病中极具发展前景。文献报道,通过鼻腔粘膜,舌下腺或小肠粘膜诱导的特异性耐受与Treg细胞有关,尤其在小肠内抗原蛋白经山树突状细胞提呈给免疫细胞,可能诱导出适合Treg产生的环境,通过抗原特异性Treg细胞的诱导发挥免疫抑制作用,相类似的作用在肿瘤浸润过程中也得到证实。 在本实验研究中,我们构建的GFP标记的CTB与人Ins融合蛋白与本实验室已有的CTB-INS融合蛋白均可诱导Ins特异的口服耐受。利用GFP标签我们追踪到融合蛋白可与小肠粘膜发生特异性结合。在小鼠血液中,我们检测到抗CTB、Ins的特异抗体亚型IgG1抗体水平升高,同时脾脏、小肠淋巴结、血液中CD4+CD25+Foxp3+T细胞与对照组相比显著增加。而脾脏淋巴细胞的增值和迁移能力受到抑制提示此融合蛋白诱导的口服耐受与特异性Treg的产生相关。NOD/SCID小鼠过继转移实验表明口服耐受诱导产生了免疫抑制性淋巴细胞。这些结果提示,在治疗T1D的过程中,口服GFP、CTB与人Ins融合蛋白通过小肠粘膜诱导的免疫耐受在外周免疫系统中上调了特异性Treg细胞,此抑制性免疫细胞可能通过抑制其它免疫细胞的生物学功能发挥其在胰岛素依赖的糖尿病治疗中的作用。这些结果提示,口服胰岛素可能是治疗T1D的一种有效并且可行的治疗策略,而口服耐受有望成为治疗自身免疫性疾病的新方法、新途径。


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