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雄性生殖相关的Kazal型蛋白酶抑制剂和精子明胶酶的结构与功能研究

钱叶青  
【摘要】:精子蛋白酶在哺乳动物生殖过程中发挥着非常重要的作用。为了防止过多的酶活性对生殖道造成破坏,蛋白酶抑制剂精确地调控着它们的活性。与哺乳动物不同,甲壳类的雄性生殖系统的蛋白酶及其抑制剂的研究十分有限。 在原先的研究中,我们发现MRPINK对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)精子的明胶和蛋白水解活性都有抑制作用。此外,MRPINK可以特异性地抑制精子明胶酶(MSG)的活性,MSG的一级结构被解析。因此,我们推测MRPINK可能在受精过程中起着十分重要的作用。考虑到物种的生殖隔离,雄性特异性分子需要被分离鉴定出来。我们提出两个有趣的问题:其他甲壳类生物的雄性生殖道KPI能够代替MRPINK在罗氏沼虾中的作用吗?KPI是否也具有物种特异性?另一方面,MSG参与到生殖过程的功能仍未阐明。 在本研究中,我们利用RT-PCR和RACE技术,从日本沼虾和中华绒螯蟹的雄性生殖道中克隆了两种Kazal型蛋白酶抑制剂基因,分别命名为Man-KPI和Ers-KPI。同时,我们用Northem blotting研究了这两个基因在各个组织中的表达特征和在雄性生殖道中的分布情况。我们分别对Man-KPI,Ers-KPI进行了原核表达,检测了它们对四种丝氨酸蛋白酶的抑制活性(trypsin,chymotrypsin, thrombin和elastase)。随后又表达了它们单独的结构域,揭示了起抑制活性的结构域。分析了Man-KPI及Ers-KPI的抑制机理并比较了它们与MRPINK对罗氏沼虾精子的抑制作用。同时我们还通过RNAi的技术,研究了MSG在受精中的作用。实验结果主要包括两大部分: 1. Man-KPI和Ers-KPI基因所编码的氨基酸序列都包含典型的Kazal结构域,其中前者具有3个结构域,后者具有4个结构域。Northern blotting表明,Man-KPI基因只在雄性生殖系统中表达,Ers-KPI表达于雄性生殖系统和血淋巴。重组蛋白rMan-KPI对elastase具有很强的抑制活性,对chymotrypsin的活性稍弱,对Trypsin的活性很弱,但对thrombin没有活性:rErs-KPI对elastase和chymotrypsin具有很强的抑制活性,对thrombin的活性很弱,但对trypsin没有活性。动力学分析表明,rMan-KPI对chymotryspin和elastase的抑制类型都是竞争性抑制;rErs-KPI对elastase的抑制类型是竞争性抑制,对chymotrypsin是非竞争性抑制。rMan-KPI的domain3是抑制chymotrypsin和elastase的活性结构域;rErs-KPI的domain2,3是抑制chymotrypsin的活性结构域;rErs-KPI的domain2,3,4是抑制elastase的活性结构域。通过明胶-SDS-PAGE,检测了相同摩尔浓度的重组蛋白的抑制活性:rMRPINK可以完全抑制精子的明胶酶活性,而rMan-KPI和rErs-KPI基本没有抑制活性。 2. Western blotting表明,MSG蛋白分布在雄性生殖系统的输精管和壶腹中,在精巢中没有分布;利用免疫组化技术研究蛋白的组织定位,结果表明MSG只在输精管和壶腹的内壁表皮细胞和精子中分布。利用免疫荧光的方法,我们进一步研究MSG在精子上的精确分布,结果表明MSG主要分布于精子的基部。为了研究MSG在罗氏沼虾体内的生理功能,我们采用RNA干涉的方法使MSG基因沉默。利用半定量PCR和Western blotting的方法检测干涉效率,我们发现核酸水平和蛋白水平都下降了80%以上,证实了干涉的有效性。利用明胶SDS-PAGE和明胶薄层分析的方法,我们发现干涉后精子的蛋白水解活力明显降低。然而,体内实验研究结果显示,MSG基因干涉后对受精和胚胎发育并没有影响。 结果表明,MRPINK对精子的抑制作用无法被其他物种中的雄性生殖相关的Kazal型蛋白酶抑制剂所取代,说明Kazal型蛋白酶抑制剂也具有物种特异性。MSG对受精作用并不是必需的,但它在罗氏沼虾受精过程中对维持精子的水解蛋白活性起着重要作用。


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