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罗氏沼虾lipocalin基因的功能研究

王墨染  
【摘要】:罗氏沼虾是一种被广泛养殖的经济型淡水虾。在日本、美国、以色列、东南亚和中国东南沿海被广泛养殖,所以这是一种容易获得的生物研究材料。它们成体的体色绚丽,在不同的时期呈现不同的特征,而且体色的变化与生长和生殖以及相对应的生长蜕皮和生殖蜕皮有着密切的关系。若从体色变化着手去研究甲壳动物的生殖与生长的关系将具有可观的应用价值。本文就以该切入点对罗氏沼虾lipocalin蛋白家族的MLC基因进行了一系列研究。 首先,我们通过设计简并引物获得了罗氏沼虾的lipocalin(载脂蛋白)家族基因MCL (Macrobrachium rosenbergii lipocalin)的片段,并通过设计核酸探针从已有的罗氏沼虾cDNA文库中筛选到了一个全长cDNA。MLC基因cDNA长726bp,具有609bp的开放阅读框(ORF),其翻译的多肽经过预测显示由17个氨基酸残基的信号肽和203个氨基酸残基的成熟肽组成。 第二,我们通过核酸探针进行Northern印记实验获得了该基因在罗氏沼虾身体各部位和生命周期各个阶段的表达特性。基因转录的量在表皮下脂肪组织(Subepidermal adipose tissue-SAT)中最高,其次是肝胰腺(Hepatopancreas-Hepa)和中枢神经组织(Central nervoussystem-CNS)。以SAT组织样品为例,我们发现从幼虾到成虾转录逐渐增多。在成熟雌虾的一个生殖蜕皮周期中,蜕皮后一天为MLC基因的转录最高峰。初步判定在罗氏沼虾中MLC和生长与生殖蜕皮有着密切的相关性。 第三,为了研究MLC基因的功能,我们采用RNA干涉的方法,使该基因表达水平降低。通过原核表达,我们制作了MLC的多克隆抗体,并用抗体检测了沼虾体内的MLC干涉效率。结果显示,随着注射双链RNA (dsRNA)剂量加大,干涉效率逐渐提高。以4μg/g (dsRNA/虾重)的剂量为例,两周后干涉效率达到90%。干涉后4周,虾体整体上全部变红,说明干涉使得结合虾青素的MLC减少,多余的游离态虾青素呈现其本身的橘红色。免疫胶体金透射电子显微镜(TEM)结果显示,MLC主要分布在紧贴着外壳的表皮下脂肪组织内的脂肪粒中。与干涉组相比,干涉后外壳中非细胞横纹结构中脂肪粒减少,细胞结构脂肪粒中的MLC蛋白也相应的减少了。这些结果表明MLC是通过在脂肪颗粒中结合虾青素而形成各种体色的。 第四,为了探究MLC基因的结合配体,我们进行了原核重组MLC蛋白体外结合活性实验。在配体与蛋白的混合溶液中我们加入镍珠,通过融合表达的His6标签将蛋白结合沉淀下来。经过洗涤和洗脱后,我们用丙酮抽提配体并进行高效液相色谱分析。结果显示,MLC蛋白能和虾青素分子、蜕皮激素分子(20-hydroxyecdysone,20-HE)在体外结合,结合率分别为1:0.29与1:0.12。 综上所述,我们认为MLC蛋白通过结合虾青素来调节罗氏沼虾的体色形成。MLC在中枢神经系统有转录和表达;MLC在皮下脂肪组织中的表达量随着蜕皮周期的变化而变化;以及MLC在体外能够结合蜕皮激素,以上三点综合反映了MLC分子还可能参与到蜕皮的过程中。但是针对MLC的RNA干涉没有影响到正常的蜕皮周期,可能是由于机体内存在着相应的补偿机制而造成的;抑或是由于该家族的基因有多个亚基的原因,其他的同源分子对蜕皮的调控作用不能完全被消除,使得单一的亚基消失不能明显造成对蜕皮的影响。蜕皮在沼虾的生命过程中具有至关重要的地位,单一分子、单一途径或许不能充分的调控整个复杂而庞大的蜕皮过程。


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