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自噬在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及机制研究

荆朝晖  
【摘要】:研究背景 蛛网膜下腔出血约占全部脑卒中的5%-10%,其中大部分的出血原因为颅内动脉瘤破裂。尽管血管介入、手术技巧、诊断方法以及围手术期的处理已经取得巨大的进步,但蛛网膜下腔出血病人的预后仍有待进一步改善。过去数十年来,脑血管痉挛和动脉瘤破裂再出血一直被认为是导致高死亡和高致残的一个主要因素。但多中心的临床试验研究表明迟发性血管痉挛的减轻并没有改善蛛网膜下腔出血患者的预后。流行病学研究提示,大约2/3的死亡发生在蛛网膜下腔出血后48小时之内,而迟发性血管痉挛多发生于出血后4天至2周左右。因此有学者提出了早期脑损伤是蛛网膜下腔出血致死致残的主要原因。 早期脑损伤这一概念指从蛛网膜下腔出血开始至72小时这一时间窗之内的脑损伤。目前蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的病理生理学机制已经有了初步的认识,主要包括颅内压升高、脑血流量降低、脑灌注压下降、有氧呼吸的抑制、血脑屏障破坏、脑水肿及神经元的死亡。然而,具体的损伤机制及信号通路还需要进一步的深入研究。 自噬是真核细胞中广泛存在的一个降解和再利用系统,对蛋白质等大分子和细胞器进行降解,表现为细胞浆中出现大量包裹者细胞浆和细胞器的空泡结构及溶酶体对空泡内成分的降解,降解产物可作为新合成蛋白质或能量代谢的原料。自噬已经证实在生物体发育、肿瘤、感染及神经退行性疾病等中起关键作用。自噬具有维持细胞自我稳态、促进细胞生存的作用,但越来越多的研究证实自噬同样也可以引起细胞死亡。因此,自噬在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用成为了目前此研究领域的热点。 在本研究中,我们分别应用自噬的诱导剂及抑制剂来调控自噬的水平,监测不同的自噬激活状态下早期脑损伤的程度,并通过检测凋亡相关蛋白来探讨自噬的作用机制,以期为蛛网膜下腔出血的治疗提供新策略和新靶点。 实验方法 1.采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血模型,成年雄性大鼠被随机分为假手术组和蛛网膜下腔出血6h、24h、72h组,通过神经功能缺陷评分,脑水肿含量测定检测脑损伤程度。采用免疫组织化学和Western blot检测自噬相关蛋白(Atg5,Beclin1和LC3)的表达,并用透射电子显微镜观察蛛网膜下腔出血模型中自噬体的形成。 2.自噬的激活剂雷帕霉素和自噬的抑制剂3-methyladenine(3-MA)分别通过侧脑室给药注射给药,成年雄性大鼠被随机分为假手术组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+雷帕霉素组和蛛网膜下腔出血+3-MA组。通过神经功能缺陷评分,脑水肿含量测定检测早期脑损伤程度。采用Western blot检测自噬相关蛋白(Atg5,Beclin1和LC3)的表达。 3.成年雄性大鼠被随机分为假手术组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+雷帕霉素组和蛛网膜下腔出血+3-MA组,采用Western blot检测凋亡相关蛋白(Bax, Bcl-2,细胞色素C和Caspase3)的表达,TUNEL法测定神经细胞凋亡程度,透射电子显微镜观察大脑皮层组织超微结构。 结果 1.蛛网膜下腔出血后脑皮层中Atg5和Beclin1的表达和LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ较对照组相比明显升高(P0.05),并且在24h达到顶峰(P0.01)。免疫荧光提示Beclin1在神经元和胶质细胞中都有表达。透射电子显微镜显示,SAH后6H、24H和72H大鼠大脑皮层神经元胞浆中双层膜结构和自噬小体明显增多。 2.雷帕霉素预处理后,蛋白Atg5和Beclin1的表达明显升高,LC-3II/LC3-I增加(P0.05);脑水肿及神经功能缺陷评分相比蛛网膜下腔出血组明显改善(P0.05)。相反,3-MA预处理下调了蛋白Atg5和Beclin1的表达,降低了LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ(P0.05),加剧了神经功能缺陷。 3.雷帕霉素预处理显著减少了Bax从胞浆至线粒体的转移,线粒体内细胞色素C的释放,Caspase3的活化和细胞凋亡(P0.05)。相反,3-MA预处理抑制了这些变化并增加了细胞凋亡。 结论 1.蛛网膜下腔出血后急性期自噬通路被激活,并且在24h达到高峰,提示自噬可能在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中起重要作用。 2.自噬诱导剂雷帕霉素提高了自噬水平,减轻了蛛网膜下腔出血后早期脑损伤。相反的,自噬抑制剂3-MA的应用降低了自噬水平,加重了早期脑损伤。 3.自噬是通过减少细胞凋亡来发挥保护作用,其中线粒体凋亡通路可能起关键作用。


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