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微囊藻毒素LR对肝细胞系HL7702内的蛋白磷酸酶PP2A下游靶点的影响

孙瑜  
【摘要】:水体富营养化导致的水华暴发不仅严重毒害水生生物,使整个水体生态失衡,并且能够通过被污染的水产品,农产品或者有毒的饮用水间接或直接危害人类的健康。微囊藻毒素(microcystin, MC)是水华暴发时蓝藻的一些属产生的次级代谢产物,化学性质稳定,很难将其从水中除去,该毒素具有多种毒性效应,因此深入研究其致毒机理具有非常重要的意义。 微囊藻毒素是一种单环七肽类化合物,其中5个氨基酸为固定成分,X,Y为两种可变氨基酸,由此可产生80多种异构体。微囊藻毒素LR(MC-LR)是微囊藻毒素中存在最为普遍且毒性作用最明显的一种,L,R分别代表亮氨酸,精氨酸。微囊藻毒素的致毒效应表现出明显的器官选择性,肝脏是微囊藻毒素最主要的靶器官。急性暴露于微囊藻毒素引起肝脏肿大,肝内出血甚至肝功能衰竭;流行病学调查表明,低浓度的微囊藻毒素长时间暴露与人群中肝癌的发生密切相关。微囊藻毒素的肝毒性是由于肝脏中表达特殊的有机阴离子转运多肽系统(organic anion transporting polypeptides, OATPs),可将微囊藻毒素大量地转运入细胞。此外,除了肝脏毒性之外,微囊藻毒素还具有肾毒性、肠毒性、生殖毒性、神经毒性,引起肾上腺,肠道相关疾病、生殖系统以及神经系统损伤等。 对微囊藻毒素致毒机理的研究表明,微囊藻毒素能够引起细胞骨架的改变、诱导细胞凋亡、诱导活性氧(ROS)生成引起脂质过氧化、激活细胞内信号传导通路等多种细胞效应。MC-LR是蛋白磷酸酶2A (Protein phosphatase 2A,PP2A)的强效抑制剂,对PP2A的特异性抑制可能是造成其毒作用机制错综复杂的原因之一。然而到目前为止,微囊藻毒素进入肝细胞后,引发的可能与PP2A相关的细胞效应以及各个细胞效应间的联系并不十分清楚。尽管目前蛋白质组学大量筛选出了可能是微囊藻毒素抑制PP2A后的下游靶点蛋白,但是这些结果并不能动态和全面的反应PP2A下游的细胞效应以及各个效应之间的联系。以肝细胞为模型来探究微囊藻毒素致毒机理的研究也非常少。 因此,为进一步探索以PP2A为主线的微囊藻毒素毒可能引起的细胞效应以及各个细胞效应间的联系,在本研究中,我们应用人肝细胞系HL7702为模型,以蛋白磷酸酶PP2A为线索,探索MC-LR抑制PP2A活性后可能引起的下游靶蛋白变化和肝细胞内的MC-LR应激效应,并试图构建以PP2A为中心的肝细胞暴露于MC-LR后的细胞内应答通路,为微囊藻毒素的致毒机理提供更多的依据。 本研究的检测内容主要包括两个部分。第一部分检测MC-LR引起的肝细胞内细胞效应,主要内容包括:检测MC-LR对蛋白磷酸酶PP2A活性的影响;MC-LR对MAPK家族蛋白的影响;MC-LR对细胞骨架以及一些骨架相关蛋白的影响;MC-LR对细胞周期的影响;MC-LR对细胞存活力的影响。第二部分检测MC-LR引起的细胞效应之间的联系,主要包括:应用PP2A激活剂D-erythro-Sphingosine(DES)后对PP2A下游影响的验证;应用MAPK激酶抑制剂检测MAPK对下游靶点的调控。 第一部分主要结果: 1. MC-LR暴露于HL7702细胞后,与PP2A催化亚基结合,抑制PP2A活性。 2. MC-LR暴露于HL7702细胞后,引起MAPK家族p38MAPK, ERK和JNK蛋白磷酸化水平升高;并且ERK, JNK的磷酸化修饰早于p38 MAPK。 3. MC-LR染毒HL7702细胞引起乙酰化微管蛋白表达降低;引起酪氨酸化微管蛋白在细胞内的排列变化;引起微丝和微管在细胞内的排列改变。 4. MC-LR染毒HL7702细胞引起Tau, HSP27, VASP蛋白磷酸化表达增加;影响Tau, HSP27在细胞骨架部分的分布。 5. MC-LR染毒HL7702细胞引起细胞周期相关蛋白p53,cdc2,cdc25c的磷酸化修饰发生改变,但是并没有引起细胞周期改变。 6.在本研究条件下,MC-LR染毒HL7702细胞并没有影响细胞存活力。 第二部分主要结果: 1.应用PP2A激动剂DES作用于细胞后,DES能够减弱MC-LR引起的Tau蛋白,HSP27的磷酸化升高效应。DES能够降低细胞周期相关的p53,cdc25c,cdc2的磷酸化水平。 2.应用免疫荧光技术分别检测B55α、B56α与细胞周期相关蛋白的共定位,结果在MC-LR处理细胞组B56α和磷酸化cdc25c出现共定位,并且共定位更多的集中在细胞膜下皮质层的胞浆中。 3.分别应用MAPK抑制剂后,验证HSP27,Tau的磷酸化水平改变,结果显示:p38 MAPK和JNK抑制剂能够减低HSP27的磷酸化修饰水平;p38MAPK抑制剂能够减低Tau的磷酸化水平。 主要结论: 1. MC-LR染毒HL7702细胞后,能够与PP2A催化亚基结合,抑制PP2A的活性。 2. MC-LR染毒能够激活MAPK三条经典的信号通路p38MAPK通路,ERK通路,JNK通路;但是p38 MAPK通路对MC-LR的反应敏感性低于ERK和JNK通路。 3. MC-LR通过影响乙酰化微管蛋白、酪氨酸化微管、F-actin和微管重新排列而引起细胞骨架的稳定性下降;PP2A被抑制激活p38MAPK引起下游Tau的磷酸化增加,从而影响Tau稳定微管的功能;p38 MAPK和JNK激酶调节下游HSP27蛋白,使HSP27蛋白磷酸化表达增加来抵抗骨架的损伤。 4. MC-LR能够通过PP2A影响细胞周期相关的蛋白p53,cdc25,cdc2的磷酸化水平改变,但是对细胞周期、细胞存活力没有影响,提示蛋白的变化早于细胞效应的改变。 5. MAPK信号通路和细胞骨架的改变很可能是MC-LR引起的早期细胞效应。


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