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胰腺癌与慢性胰腺炎的胰液差异蛋白组学研究

陈佳敏  
【摘要】:胰腺癌是一种恶性度高,手术切除率低,进展迅速,预后差的消化系统恶性肿瘤,5年生存率不足5%,通常诊断明确时已发生转移。据2002年WHO统计,世界上每年有胰腺癌新发病例约20万人,占全部恶性肿瘤新发病的2.1%,每年死亡人数约19.6万人,占全部恶性肿瘤死亡率的3.4%,占恶性肿瘤死亡率的第8位。在我国目前胰腺癌的发病率也呈逐年增高趋势。由于胰腺癌对放、化疗不敏感,早期诊断并行肿瘤根治手术是是提高患者生存率的唯一有效的方法。但目前胰腺癌早期诊断水平差,目前胰腺癌的常用的临床诊断标志物是CAl9-9,但是在一些良性胆道、胰腺疾病中CAl9-9也会升高,例如急、慢性胰腺炎,肝炎和胆道梗阻等,其对胰腺癌诊断的敏感性和特异性分别为93.1%和78.3%,不能令人满意。而影像学检查发现异常时通常已到了疾病中晚期,失去了早期手术的时机。因此探寻更敏感的早期胰腺癌的特异性标志物是临床研究的一个迫切需求。另外胰腺癌与慢性胰腺炎的临床关系尚不明确,胰腺炎的支架治疗对临床症状的改善有较多研究,但支架治疗在蛋白质水平上对胰腺病理/组织学的改善指标目前未见相关研究。 蛋白质是生命活动的具体执行者和体现者,因此深入研究胰腺癌的发病机制,寻找特异、灵敏的标志物用于早期诊断,客观上要求在蛋白质组的水平进行进一步探索。近年来开展的表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(Surface EnhancedLaser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, SELDI-TOF-MS)技术为这一探索提供了优良的技术平台。SELDI-TOF-MS技术由蛋白质芯片系统和质谱仪组成,尤其适用于低丰度蛋白质或多肽的检测。这一方法最大的优势在于高通量、高灵敏度的实现了质谱技术对临床样本的直接检测。SELDI-TOF-MS技术问世后被认为是最有前景的肿瘤早期检测技术。另外该技术在其他疾病,如心脏病、肾移植、艾滋病、阿尔茨海默病等也陆续有相关应用研究的报道。 本课题旨在应用SELDI蛋白质指纹图谱和生物信息学技术从胰液中筛选胰腺癌蛋白质肿瘤标志物并构建检测模型(pattern);建立组织蛋白质指纹图谱的检测方法从而寻找胰腺癌与慢性胰腺炎胰液间的差异表达蛋白质;并进一步分析慢性胰腺炎胰管支架治疗前后胰液蛋白组学的差异。以期找到适合胰腺癌早期诊断的候选肿瘤标志物,为探索胰腺癌发病机制提供新思路。 第一部分胰液蛋白质指纹图谱在胰腺癌中的研究 目的: 通过SELDI-TOF-MS技术研究胰腺癌与慢性胰腺炎患者的胰液蛋白质组学差异,寻找可早期诊断胰腺癌的蛋白质标志物。 方法: 1.ERCP胰管插管抽取胰腺癌与慢性胰腺炎的胰液,预处理标本 2.将蛋白芯片与胰液样本预处理后结合、冲洗,加能量吸收分子(EAM),设置SELDI质谱仪参数,质谱检测及数据处理 结果: 1.检测胰腺癌胰液样本6例,慢性胰腺炎组胰液样本8例,Non-parametric (Wilcoxson T test)检验筛查p值小于0.05的差异蛋白质。 2.共检测到402个经过信噪比和强调过滤的高质量质谱蛋白质峰,发现有20个蛋白质峰含量有统计学差异(P0.05)。其中1944.039m/z,1263.395m/z,1231.336m/z,3140.118m/z,1244.721m/z,4354.719m/z,1224.074m/z,4252.905m/z,7922.402m/z,2359.206m/z,1875.959m/z,1438.699m/z,4557.361m/z,2090.424m/z,3864.683m/z,1867.903m/z等16个蛋白质峰在胰腺癌中明显高于慢性胰腺炎组,而2003.693m/z,3652.22m/z,1982.035m/z,13209.86m/z等4个蛋白质峰在慢性胰腺炎组高于胰腺癌组。 3.t检验、Mann-Whitney秩和检验初步筛选出了3个单独区分两组能力最强的蛋白质峰m/z1231.336,m/z2090.424,m/z7922.402,经过计算筛选出最佳组合是:m/z1231.336,m/z2090.424,即由这2个蛋白质峰构建的模型可达到最佳检测效果。测试集盲法验证的总准确率为100%、灵敏度100%、特异度100% 4.生物信息学查询鉴定了多种差异蛋白质,其中神经肽、CD24、tRNA甲基转移酶等在胰腺癌和慢性胰腺炎胰液中有显著差异。 结论: 1.找到了胰腺癌和慢性胰腺炎胰液的20个差异蛋白质峰,其中m/zl231.336,m/z2090.424,m/z7922.402三个蛋白质峰的差异最显著 2. m/zl231.336.m/z2090.424两个蛋白质峰组合所构建的模型能达到鉴别胰腺癌和慢性胰腺炎的最佳检测效果,总准确率100% 3.CD24、tRNA甲基转移酶在胰腺癌胰液中显著高于慢性胰腺炎,揭示了二者可能在胰腺癌的发生发展中重要作用 4. SELDI-TOF-MS技术的特异性及敏感性高,其结果对进一步研究胰腺癌的蛋白质组学改变及其临床诊断应用具有重要意义 第二部分慢性胰腺炎支架治疗前后胰液蛋白质指纹图谱研究 目的: 通过SELDI-TOF-MS技术研究慢性胰腺炎患者胰管支架治疗前后的胰液蛋白质组学差异。 方法: 1. ERCP胰管插管抽取慢性胰腺炎患者植入胰管支架治疗前后的胰液,预处理标本 2.将蛋白芯片与胰液样本预处理后结合、冲洗,加能量吸收分子(EAM)设置SELDI质谱仪参数及数据处理 结果: 1.检测胰慢性胰腺炎组胰液内镜治疗前样本8例,内镜植入支架后胰液样本8例,Non-parametric (Wilcoxson T test)检验筛查p值小于0.05的差异蛋白质。 2.共检测到471个经过信噪比和强调过滤的高质量质谱蛋白质峰,发现有18个蛋白质峰含量有统计学显著性差异(P0.01),建立SVM判别模型,区分阳性组和阴性组的准确率为100%。其中941.1204m/z,1015.591m/z,2007.972m/z,2569.366m/z,2041.688m/z,2021.02m/z,5298.32m/z7个蛋白质峰在治疗前明显高于支架治疗后,而5179.94m/z,5816.584m/z,5412.789m/z,2569.366m/z,1930.04m/z,4140.885m/z,6901.154m/z,10518.64m/z,6510.874m/z,7183.722m/z,5951.249m/z11个蛋白质峰在支架治疗后明显高于治疗前。 3.生物信息学查询鉴定了多种差异蛋白质,其中uPA、PYY、MT等在慢性胰腺炎支架治疗后的胰液中较治疗前明显升高 结论: 1.慢性胰腺炎支架治疗后存在胰液蛋白质组学改变,发现了18个差异显著的蛋白质峰 2. uPA、PYY、MT可能是慢性胰腺炎治疗后反映其病理生理改善的蛋白组学指标 3. SELDI-TOF-MS技术的特异性及敏感性高,其结果对进一步研究慢性胰腺炎支架治疗前后的蛋白质组学改变及其临床意义有重要价值。


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