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人核糖核苷酸还原酶的质子电子偶联传递通路研究

陈新焕  
【摘要】:核糖核苷酸还原酶(RR)存在于所有的生物细胞中,其功能是将核糖核苷酸(NDPs)还原为脱氧核糖核苷酸(dNDPs),是DNA合成限速酶,其活性直接影响细胞增殖及肿瘤发生发展,是抗肿瘤药物的重要靶标分子。RR结构和功能研究为阐明其酶活性机制和研发靶向抗肿瘤药物提供理论和实验依据。根据金属辅助因子不同,RR可分为三类,而基于序列同源性和别构调节机制,第Ⅰ类又可进一步分为la, Ib, and Ic三个亚类,人、鼠和大肠杆菌等的RR属于Ia亚类。目前对Ia RR结构和功能的研究主要是以大肠杆菌为模板,其中经典模型认为它是两个R1大亚基和两个R2小亚基组成的异四聚体。在大肠杆菌RR,存在着一条双向的质子电子偶联传递通路,由R2上的·Tyrl22→Trp48→Tyr356和R1上的Tyr731→Tyr730→·Cys439组成,能够将自由基从R2上的·Tyrl22传递到35?距离之外的R1的·Cys439上,为RR酶催化活性所必需。在R2参与电子传递的具有氧化还原活性的氨基酸残基附近需要一个质子传递媒介,从而实现长距离电子传递与短距离的质子传递相偶联。R2的Tyr356位于大、小亚基之间,Trp48与Tyr356以及R1之间的质子电子偶联传递机制长期以来尚未阐明。 本课题以人RR小亚基M2(hRRM2)为研究模型,试图找出Trp102(对应大肠杆菌Trp48)和Tyr369(对应大肠杆菌Tyr356)之间参与质子电子偶联传递的重要氨基酸位点。首先我们构建了野生型和突变型hRRM2表达质粒,通过原核表达和纯化得到hRRM2蛋白,筛选获得晶体,经x线衍射解析得到hRRM2的晶体结构(PDB:30LJ;分辨率2.1?)。然后,根据我们解析的hRRM2晶体结构,将Trp102周围5?内的6个氨基酸全部突变成丙氨酸。酶活性分析结果显示,只有hRRM2突变体E106A的酶活性完全丧失。为了进一步证明Elu106的重要性,我们将hRRM2的Elu106进行多种类型突变,结果显示只有hRRM2突变体E106D具有10%的酶活性,而其余hRRM2突变体,如E106Q、E106A、E106R、E106K.E106L和E106Y的酶催化活性都完全丧失,进一步证实了hRRM2的Elu106位点在RR酶催化中是必需的。 表面等离子体共振(SPR)研究结果显示,hRRM2突变体E106D和E106Q不影响hRRMl和hRRM2的结合;x线衍射晶体结构分析显示,hRRM2突变体E106A、E106D和E106Q与野生型hRRM2的结构差别微小,排除Elu106突变通过影响蛋白空间构象而影响酶的催化活性;电子顺磁共振(EPR)检测显示,hRRM2突变体E106A、E106D和E106Q也能形成双铁-酪氨酰自由基中心,并且强度与野生型蛋白一致,表明Elu106不参与酪氨酰自由基的形成。应用RR自杀性抑制剂2-叠氮-2-脱氧-胞苷二磷酸(CzDP)实验证实,hRRM2突变体E106A和E106Q中自由基传递通路是阻断的,而hRRM2突变体E106D具有部分自由基传递的功能。基于蛋白晶体结构,构建hRRM1和hRRM2全酶模型并进行动力学分析和理论计算表明,hRRM2的Elu106为hRR质子电子偶联传递通路关键位点,其机制是作为hRRM2的Tyr369的质子传递媒介参与酶活性必需的自由基传递。 以上研究首次发现Elu106是一个新的RR酶活性关键位点,其机制是作为hRRM2质子电子偶联传递通路中的质子受体/供体而为酶活性所必需。同时,基于蛋白晶体结构,首次提出人RR的全酶结构模型。这些结果对于进一步阐明RR酶分子的质子电子偶联传递机制具有重要意义,并为设计新的抗肿瘤药物提供了RR结构和功能相关的重要实验依据。


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