米非司酮的糖皮质激素拮抗效应对人子宫NK细胞的影响及机制研究

【摘要】：米非司酮是一种人工合成的19-去甲基睾酮衍生物,具有抗孕激素和糖皮质激素作用。从首次合成米非司酮以来,米非司酮已被广泛用作抗早孕治疗,并成功用于紧急避孕。多年来的基础和临床研究表明,米非司酮在妇产科学、内分泌学、肿瘤学及免疫学等多个领域表现出一定的应用潜力。近年的研究表明,米非司酮对女性的排卵、激素水平以及月经出血模式没有明显影响,但是能够延缓子宫内膜的成熟,从而达到内膜避孕的作用。然而,米非司酮内膜避孕的作用机制还不十分清楚。第一部分人子宫内膜间质细胞对uNK细胞体外存活及功能的影响目的：明确人子宫内膜间质细胞对uNK细胞体外存活、增殖及毒性功能的影响。方法：分离不同时期女性子宫内膜和蜕膜间质细胞,体外培养制备间质细胞条件培养液。从早孕蜕膜组织中分离、分选得到高纯度的人uNK细胞,采用流式细胞方法检测细胞的表型。在光镜下观测了不同时期间质细胞条件培养液对uNK细胞形态学的影响；采用基于乳酸脱氢酶活性为基础的MTS试剂盒检测不同时期间质细胞条件培养液对uNK细胞增殖的影响,并采用流式细胞方法检测uNK细胞对靶细胞K562的细胞杀伤作用。结果：在本实验中,采用细胞免疫磁珠分选方法可以得到高纯度的人uNK细胞(94.52±2.44%)。外源性IL-2能够明显维持uNK细胞的体外存活,并对靶细胞的细胞毒性有促进作用。单独的不同时期间质细胞条件培养液均不能维持uNK细胞的体外存活,但分泌期和早孕期间质细胞条件培养基能够明显增加uNK细胞体外增殖(1.12±0.03和1.22±0.06,p0.05)。与对照组相比(63.39±±5.18%),不同时期间质细胞条件培养液均能明显降低uNK细胞毒性功能(46.98±±3.58%,45.28±±4.05%,43.72±±1.67%,p0.05),而这种抑制作用在不同时期间质细胞条件培养液间并没有显著差异(p0.05)。结论：人子宫间质细胞条件培养基不能维持uNK细胞的体外存活,但能够通过细胞增殖和毒性的影响来调节uNK细胞功能。第二部分米非司酮对人子宫NK细胞生物活性的影响目的：研究米非司酮对人uNK细胞体外增殖、凋亡、IFN-γ分泌、细胞毒性功能及穿孔素和颗粒酶-B蛋白表达水平的影响。方法：体外分选得到的高纯度人uNK细胞,采用不同浓度米非司酮进行体外处理。采用MTS试剂盒检测细胞增殖情况；采用流式细胞方法检测细胞凋亡、毒性功能及毒性颗粒的表达情况；ELISA试剂盒检测细胞IFN-γ分泌水平。结果：不同浓度米非司酮对人uNK细胞的体外增殖、凋亡及IFN-γ的分泌功能均没有明显影响。经65nmol/L和200nmol/L的米非司酮处理后,uNK细胞的毒性分别为68.92±5.96%和69.62±4.22%,虽然高于对照组(62.24±4.39%),但没有显著性差异(p0.05)；1000nmol/L的米非司酮能够明显增加其细胞毒性(73.16±4.27%,p0.05)。1000nmol/L米非司酮不会影响人uNK细胞颗粒酶-B的蛋白表达(50.50±0.02%和45.97±0.03%,p0.05),但能够增加穿孔素的蛋白表达水平(49.13±0.03%和36.23±0.05%,p0.05)。结论：米非司酮对人uNK细胞的体外增殖、凋亡及IFN-γ的分泌功能均没有影响,但可能通过对穿孔素表达水平的上调作用来增加uNK细胞的毒性功能。第三部分米非司酮在人子宫NK细胞毒性调节中的作用及机制目的：研究米非司酮的糖皮质激素拮抗效应在人uNK细胞毒性功能和穿孔素蛋白表达调节中的作用及可能的信号途径。方法：体外分离得到的高纯度人uNK细胞,分别采用不同浓度的孕激素、皮质醇以及米非司酮进行体外处理。采用流式细胞方法检测了uNK细胞毒性功能和穿孔素蛋白的表达情况；采用免疫蛋白印迹检测了ERK1/2、p38和JNK蛋白磷酸化水平的变化；采用ERK1/2蛋白活化的特异性抑制剂PD98059检测了ERK1/2活性在米非司酮诱导的uNK细胞毒性功能和穿孔素表达调节中的作用。结果：不同浓度的孕激素对uNK细胞毒性没有明显影响；而1×10-6M和1×10-5M的皮质醇能够明显降低uNK细胞的细胞毒性(55.07±4.04%、56.20±3.11%和62.30±2.69%,p0.05)。1×10-6M的米非司酮能够促进uNK细胞毒性功能(62.30±2.69%和73.16±4.26%,p0.05)和穿孔素蛋白的表达(36.23±4.84%和49.13±2.92%,p0.05)；1×10-6M皮质醇能够抑制米非司酮对uNK细胞毒性功能(73.16±4.26%3和66.92±2.87%,p0.05)和穿孔素蛋白表达的诱导(49.13±2.92%和33.14±3.45%,p0.05)。1×10-6M的米非司酮能够增加ERK1/2蛋白的磷酸化水平,但对p38和JNK蛋白磷酸化水平没有明显影响；皮质醇对米非司酮诱导的ERK1/2蛋白的磷酸化水平具有抑制作用(0.87±0.09和0.48±0.07,p0.05)。此外,PD98059能够明显降低米非司酮对uNK细胞毒性和穿孔素蛋白表达的诱导作用。结论：米非司酮通过糖皮质激素拮抗效应来促进人uNK细胞毒性功能和穿孔素的表达,并诱导ERK1/2蛋白的磷酸化。ERK1/2信号途径可能参与了米非司酮对uNK细胞毒性功能和穿孔素表达的调节。