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广西地区HIV-1流行亚型、基因变异性分析及耐药突变的实验研究

齐海燕  
【摘要】:艾滋病,即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)引起的一种免疫缺陷性疾病。人体感染艾滋病毒后,机体免疫功能逐渐降低,最后因为各种机会性感染而导致死亡。自1985年发现首例HIV-1感染者以来,艾滋病快速蔓延已经成为全球瞩目的问题。2009年数据显示,艾滋病流行至今,全球大约已有6000万人感染了艾滋病病毒,其中有2500万人死于该疾病。在中国,艾滋病也呈加速流行和蔓延的趋势。根据中国卫生部、联合国艾滋病规划署(UNAIDS)和世界卫生组织(WHO)联合公布的2011年中国艾滋病疫情数据显示,截至2011年底,中国艾滋病病毒感染者和艾滋病病人(PLHIV)总共78万。中国已经成为艾滋病流行大国。广西省由于其特殊的地理位置,一直是艾滋病流行较早及较为严重的城市。因此,有效地预防和治疗艾滋病已成为当务之急。本实验收集了2008-2010年广西北海、百色、南宁三个地区静脉吸毒人群67例,分别对Gag/Pol及Env基因进行扩增,并对该地区主要流行毒株亚型特征、基因变异及耐药突变做出了详细分析。本研究分为以下三个部分: 第一部分 广西地区HIV-1流行亚型分析 本部分实验旨在了解我国广西地区HIV-1毒株亚型的流行状况,我们于2008至2010年分别在百色、南宁、北海等地区采集了67例HIV-1阳性标本,经巢式PCR扩增、纯化、测序,得到的序列用DNASIS软件进行编辑、校正后,使用ClustalW软件与美国LosAlamos National Laboratory HIV Sequence Database HIV核酸序列库提供的参考序列进行比较,利用Mega5软件中Neighbor-joining(N-J)method进行系统进化树的构建。使用Bootstrap对neighbor-joining系统树和数枝形状的可信性进行检验,重复1000次。 67例Gag-Pol序列与国际各亚型标准序列进行系统进化树分析显示,在广西省不同地区,由于HIV-1传播的来源不同,使得HIV-1亚型复杂多样。在北海地区的25例标本中,14例为CRF08-BC(56.0%),9例为CRF01-AE(36.0%),2例是CRF07-BC(8.0%)。南宁地区21例标本中,16例为CRF08-BC(76.19%),3例为CRF01-AE14.28%),剩余2例为CRF07-BC(9.52%)。值得注意的是我们检测的百色21例标本中,只发现了CRF08BC这种重组毒株。说明这种亚型可能是百色静脉吸毒人群中HIV-1流行的主要毒株。其中被确定为CRF07-BC亚型的4个序列中,P6domain均发现有7个氨基酸的缺失,但其生物学意义还不是十分清楚。 追踪HIV-1传播路线时我们发现,云南是我国HIV-1感染最早的城市之一,该地区的主要流行毒株是CRF08BC,而且百色与云南地理位置较为接近,所以我们有理由相信HIV-1的传播路线就是从云南省到广西省这样一个与毒品交易相符的传播过程。随着广西省从西向南地理位置的迁移,我们发现,主要感染人群的CRY08BC重组毒株的比例在逐渐下降,而CRY01 AE重组毒株的比例却在逐渐上升。给我们展现出两种完全不同的重组形式在地域分布上的特点。 第二部分HIV-1基因变异分析 本部分我们比对了采集标本中亚型为CRF08BC的所有序列,(通过Gag-Pol序列建立的系统进化树确定)分析24条Envlope C2V4区氨基酸序列未发现重排及终止码子,能翻译成正确的氨基酸阅读框架。在HIV-1的5个可变区中,氨基酸变异主要发生在V4区和C3区,V3区氨基酸序列则表现的比较保守。在24个序列中除了BS079、NN002、BH074、及NN025这四个序列,其余序列均发现高度保守的十二肽段RIGPGQTFYATG.这个特殊的结构以前也有过报道。在我们对序列的分析中发现BH074、及NN025这两个序列中包含了不确定的氨基酸“x”,但是实际上这些位点的氨基酸可能与参考序列的氨基酸是相同的。但在V4loop中我们就没有发现这样类似的氨基酸片段。我们把本实验的序列,与本课题组以前研究的2000年广西地区的32例标本序列做了氨基酸比对发现,在整个C2-V4区,除了恒定区C2变异度较低外,其它V3、C3、V4区氨基酸突变率均较高。总体分析显示与97CNGX-7F参考序列相比,2008年-2010HIV-1毒株平均氨基酸突变数量为24个,范围从5个到36个。而2000年氨基酸突变率就相对较低,平均为11个,范围从5个到17个。这说明随着时间的推移,病毒基因组在不断的进化,新收集的标本与8-10年前收集的标本相比,与印度C亚型的氨基酸序列差异越来越明显。多个位点的突变率都有上升的趋势,只有335K这个位点的氨基酸显示出较强的保守性。 第三部分 HIV-1耐药基因突变分析 HIV-1耐药突变主要是由于抗病毒药物的广泛及不规范的应用,病毒在选择压力下逐渐进化而形成的。本部分研究旨在了解广西地区HIV-1耐药性的流行情况,对治疗方案的制定提供有力的依据。我们把得到的每个序列都提交到斯坦福大学的HIV耐药数据库中进行分析,发现三个不同城市采集的标本中凡是亚型确定CRF08BC,在其RT区均发现T69S耐药突变。T69S突变经常是在NRTI治疗中被选则出来的耐药位点。除了T69S以外,我们还发现了其它的耐药突变,包括,在PI S主要耐药突变M46I,但在对百色序列的分析中,我们却没有发现这个耐药位点的存在,这说明百色地区蛋白酶抑制剂耐药毒株的传播可能处于较低的水平。M46I耐药突变的产生,会导致HIV-1毒株对阿扎那韦、福沙那韦、印地那韦、洛匹那韦、奈非那韦药物产生耐药。K101Q是多态性附属突变,它主要作用是调节其他NNRTIs的耐药性突变。该位点的突变可以降低病毒对奈韦拉平、依法韦伦及ETR的敏感性。L106I及K103R耐药突变主要发生于RT区, L106I在HIV-1序列中是一个非常普遍的多态性位点,而K103R在1-2%未经抗病毒药物治疗的人群中也会存在。所以只有在与V179D耐药突变同时存在时,才能降低对NNRI药物的感受性。此外在BH045和NN020标本中又发现了P1次要突变LIOI,这个耐药突变在未经治疗的人群中也有报道,大约在5%-10%之间,所以只能引起较小范围的耐药。NRTI相关耐药突变K65R是我们发现的一个高度耐药突变,它能对去羟肌苷、阿巴卡韦、拉米夫定、替若福韦等药物产生中度耐药。同对司他夫定、齐多夫定产生低水平的耐药。


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