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钙调素拮抗剂枸橼酸汉防已甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究

许晓华  
【摘要】:研究背景: 慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种造血干细胞的克隆性疾病,约占成人白血病的15%-20%,是严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。CML患者存在Ph染色体,即9号染色体c-ab1癌基因易位到22号染色体bcr基因处,形成bcr-abl融合基因,bcr-abl融合基因编码BCR-ABL融合蛋白,该蛋白具有酪氨酸激酶活性,促进细胞异常增殖,导致CML的发生和发展。伊马替尼(Imatinib)是一种酪氨酸激酶抑制剂,对CML患者具有良好的疗效,并于2001年获美国FDA批准成为治疗CML的一线药物。然而,已有越来越多的临床和实验研究资料显示,伊马替尼虽然对CML慢性期患者有较好的疗效,却对急变期CML疗效较差,而且随着伊马替尼的广泛应用,发现有相当一部分患者出现耐药。研究认为分子靶向药物对急变期CML无效主要与其致病基因bcr-abl发生突变有关,如T315I突变。T315I突变患者不仅对第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼耐药,对第二代酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib)和尼洛替尼(Nilotinib)也耐药。近年来,随着对白血病细胞生物学和分子生物学特性研究的深入,发现白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)不仅是CML对分子靶向药物耐药的关键因素,而且在白血病起始和复发中也起着重要的作用,LSC是CML长期缓解和治愈的主要障碍之一。CML患者要获得长期缓解和治愈,必需清除这些白血病干细胞。因此,筛选和鉴定白血病干细胞治疗性药物靶标,阐明其作用分子机制,以及研发相应药物是目前迫切需要解决的问题之一。目前抗肿瘤药物大多存在毒副反应大,价格昂贵等不足,因此寻找高效低毒价廉的抗肿瘤药物和方法,提高患者生存质量已成为医学研究的热点。 汉防己甲素(tetrandrine,TTD)又名粉防己碱,是从防已科千金藤属植物粉防己(Stephamia tetrandra S. Moore)块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱,是一种钙调素拮抗剂,对多种肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制作用。有文献报道钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ(CaMKⅡ γ)在很多肿瘤细胞中呈异常表达,研究发现CaMKⅡγ在髓系白血病细胞中呈异常激活状态并调节白血病细胞的增殖。汉防己甲素对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562细胞和多药耐药株K562/ADM细胞体内外均有较好的抗增殖和逆转多药耐药的作用,但其作用机制尚缺乏深入的研究。因此,本文以K562细胞及伊马替尼耐药的K562R细胞和慢性粒细胞白血病患者原代细胞为研究对象,探讨钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素(Tetrandrine citrate, TTDC)体内外抗慢性粒细胞白血病作用及其可能的机制。 第一部分:枸橼酸汉防己甲素抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体外研究 目的:检测枸橼酸汉防己甲素对人慢性粒细胞白血病细胞增殖抑制作用。 方法:用TTDC处理慢性粒细胞白血病细胞株(K562细胞和K562R细胞)和慢性粒细胞白血病患者原代细胞,采用MTT检测处理前后对白血病细胞的增殖抑制作用,Wright-Giemsa染色观察细胞的形态的变化;流式细胞仪分析细胞DNA含量及细胞凋亡;甲基纤维素克隆形成试验检测TTDC对白血病细胞克隆的增殖抑制作用;运用Western Blot技术检测BCR-ABL蛋白及其磷酸化蛋白表达。 结果:不同浓度(0~16μg/m1)的TTDC分别作用于K562细胞和K562R细胞24h、48h、72h能显著抑制K562细胞和K562R细胞的增殖,其作用具有浓度-时间依赖性,TTDC对K562细胞和K562R细胞在48h IC50分别是2.78μg/ml和3.51μg/ml,同样TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞也具有增殖抑制作用而对正常造血细胞没有明显抑制作用。TTDC处理K562R细胞出现凋亡细胞形态学的改变和凋亡细胞比例的增加,K562R细胞经1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml和8.0μg/mlTTDC分别处理48h后,早期凋亡细胞比例分别为3.1%,7.3%,50%和76%,呈明显递增趋势,甲基纤维素克隆形成试验结果显示TTDC能抑制CML细胞克隆形成,同时观察到经TTDC作用后P210BCR-ABL蛋白表达量明显下降。 结论:TTDC能够抑制K562细胞和K562R细胞的增殖,其作用具有浓度-时间依赖性,对慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞增殖和克隆形成具有抑制作用而对正常外周血单个核细胞抑制作用不明显;TTDC对白血病细胞增殖抑制作用与诱导细胞凋亡和抑制CML关键性分子P2108CR-ABL蛋白的表达有关。 第二部分枸橼酸汉防己甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞增殖的体内研究 目的:观察枸橼酸汉防己甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞移植瘤的生长及其安全性。 方法:用BALB/C nu/nu裸鼠建立伊马替尼耐药的K562R细胞的异种移植瘤模型,皮下接种K562R细胞浓度为2×107/0.2ml,待肿瘤体积为50-100mm3时分成对照组和给药组,给药组伊马替尼和TTDC均口服给药剂量为100mg/kg,每日三次连续给药10天,饲养至35天。对照组给予等体积生理盐水。分别观察伊马替尼、TTDC治疗组和对照组荷瘤裸鼠的抑瘤效果及其副作用。 结果:裸鼠在接种K562R细胞后第3-5天,腋下就能摸到米粒大小的瘤块,提示荷瘤裸鼠建模成功,本研究分两批进行,实验动物共25只,成瘤率为100%,伊马替尼给药组存活率7/7(100%),其中3只荷瘤裸鼠的肿块消失,无瘤生存率为3/7(42.9%);而对照组3只裸鼠因肿瘤负荷过大死亡,存活率3/6(50%)。至给药后35天,对照组和伊马替尼给药组存活裸鼠平均肿瘤重量分别为2.24±0.25g和1.02±1.23g,对照组大于伊马替尼组。TTDC给药组6只荷瘤裸鼠的肿瘤生长均得到抑制,其中5只肿瘤消退,1只明显缩小,存活率6/6(100%),无瘤生存率达5/6(83.33%),抑瘤率为91.60%;而对照组6只裸鼠的肿瘤均继续生长,其中一只裸鼠因肿瘤负荷过大死亡,存活率5/6(83.33%),至给药后35天,对照组和TTDC组存活的荷瘤裸鼠平均肿瘤重量分别是2.20±0.77g和0.135±0.32g,两组间差异具有统计学意义(p值0.05)。在TTDC给药期间,裸鼠一度体重低于对照组,但后又缓慢增长,裸鼠无脱发,食欲、活动能力、精神状态良好,提示TTDC对BALB/c-nu/nu裸鼠没有明显的毒副反应。 结论:TTDC在裸鼠体内对伊马替尼耐药的K562R细胞的异种移植瘤具有良好的抑瘤作用,在实验期间裸鼠没有出现明显的毒副反应。 第三部分枸橼酸汉防己甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖机制的研究 目的:研究枸橼酸汉防己甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖的可能的机制。 方法:采用Western blot技术检测CaMKⅡγ、pCaMKII γ和β-catenin蛋白的表达用流式细胞分选仪分选CD34+CD38细胞,应用基因转染技术建立CaMKⅡ γ高表达稳转细胞(转染pcDNA3.1-CaMKII y-EGFP质粒的K562细胞),运用激光共聚焦显微镜观察CaMKⅡ γ的亚细胞定位,并用流式细胞仪检测CaMKⅡ γ在细胞周期中的表达。 结果:pCaMKⅡ γ激酶在5例CML急变期患者的细胞中呈高表达,同时伴有β-catenin表达水平的增高,而在6例慢性期患者的细胞中两者表达水平均较低,甚至不表达。CaMKⅡ γ激酶在CD34+CD38-的CML细胞群中呈异常激活和高表达状态,而在CD34-的CML细胞群和正常脐血CD34+CD38-细胞群中呈低表达。在高表达CaMKⅡγ的K562细胞中CaMKⅡ γ荧光信号在S/G2期达到最高,细胞周期的检测中也发现转染pcDNA3.1-CaMKII y-EGFP质粒的K562细胞在G2/M期的比例明显高于对照。经0-4μg/mlTTDC处理K562R细胞48小时后发现随着TTDC药物浓度的增加pCaMKⅡ γ蛋白表达水平显著下降,并呈现与(3-catenin蛋白表达量下降同步,而CaMKⅡ γ表达水平无明显变化。 结论pCaMKⅡ γ激酶在CML急变期患者的原代细胞和CD34+CD38-的CML细胞群中呈异常高表达,并与β-catenin呈同步表达;根据CaMKⅡ γ激酶的亚细胞定位和不同细胞周期的表达量,推测其与CML细胞增殖相关;TTDC可以通过抑制磷酸化的CaMKⅡ γ激酶活性并同步下调β-catenin蛋白发挥抗白血病作用;推测CaMKⅡ γ激酶与wnt/β-catenin信号通路间可能存在相互联系。


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