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α-半乳糖苷酶碳源诱导机制研究及复合酶制剂的开发

顾丰颖  
【摘要】:α-半乳糖苷酶(a-D-galactoside galctohydrolases,EC3.2.1.22)属于外切糖苷水解酶(exo-glycosidase)的一种,分属于糖苷水解酶中GH4、GH27、GH36、GH57和GH97等多个家族。该酶广泛的存在于微生物、植物和动物中,可特异性水解半乳糖残基的非还原性末端α-1→6半乳糖苷键。20世纪70年代起,我国开始对该酶的开发利用进行研究,该酶被认为是食品工业、轻工业、饲料工业、制药业中最具有应用潜力的酶制剂之一。本文从α-半乳糖苷酶高产菌种选育出发,探讨产α-半乳糖苷酶的碳源诱导机制,优化其固体发酵条件及培养基组成,在此基础上以廉价的农产品加工副产物为培养基开发“以α-半乳糖苷酶为标志”的饲用复合酶制剂。论文的主要研究结果如下: 实验采用X-a-Gal初筛、液体摇瓶复筛并进一步考察固体发酵能力,从实验室保存菌株及传统发酵豆制品中筛到菌株J-08,具有良好的液体发酵(3.88U/mL)及固体发酵(57.21U/g干基)产酶能力,将其编号为zju-Y1。经形态,BIOLOG生理生化分析及18S rRNA分子鉴定后,确定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。 研究多种农产品加工副产物对黑曲霉zju-Y1产α-半乳糖苷酶的影响,并通过分析各农产品加工副产物组分推测,水苏糖是黑曲霉zju-Y1产α-半乳糖苷酶最有效的诱导因子之一。进一步采用单一碳源发酵验证,确定在小分子量碳源(单/寡糖)中,水苏糖具有最显著的诱导产酶效应,而在大分子碳源中瓜尔豆胶的诱导效应最为显著。 采用实时荧光定量PCR技术对不同碳源诱导下黑曲霉zju-Y1三个α-半乳糖苷酶表达基因(aglA、aglB、aglC)在转录水平上的分析可知,三个基因对碳源的诱导敏感度为aglCaglBaglA;碳源对基因表达上调程度的影响为:水苏糖瓜尔豆胶半乳糖葡萄糖。进一步对黑曲霉zju-Y1生物质降解酶调控因子转录表达水平分析认为,转录激活因子XlnR及AmyR对α-半乳糖苷酶表达基因可能存在调控作用。 通过单因素实验确定采用250mL三角瓶固体发酵黑曲霉zju-Y1生产α-半乳糖苷酶的最优发酵条件为发酵温度为28℃,培养基初始水分含量为60%,初始pH为5.5,接种量12%,载曲量为25g(湿基)。 以农产品加工副产物(豆粕、麸皮)为主添加少量诱导物作为培养固体基质,经响应面优化后得到最佳培养基组成为(g/10g干基):豆粕粉1.3782g,麸皮8.0916g,瓜尔豆胶0.4802g, KH2PO40.01g, MnSO4·H2O0.04g。用此培养基发酵96h后最大酶活为265.934U/g干基。 实验表明黑曲霉zju-Y1具有强大的水解酶酶系,在纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶和酸性蛋白酶等方面均有良好的产酶能力。本文在优化的α-半乳糖苷酶固体培养基为基础上,采用响应面分析方法分别建立纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶和酸性蛋白酶培养基组成与酶活响应值得函数模型。 分别设计家禽/畜用复合酶复配比例,应用穷举法数值计算,获得满足设计的培养基组成。通过黑曲霉ziu-Y1单一菌种一次发酵,获得“以α-半乳糖苷酶为标志”的家禽用复合酶制剂A,其组成为α-半乳糖苷酶243.67U/g干基,纤维素酶431.62U/g干基,α-淀粉酶339.77U/g干基,果胶酶382.19U/g干基,酸性蛋白酶为3689.16U/g干基;以及家畜用复合酶制剂B,其组成为α-半乳糖苷酶235.66U/g干基,纤维素酶428.17U/g干基,α-淀粉酶362.73U/g干基,果胶酶359.21U/g干基,酸性蛋白酶为3614.25U/g干基。 分析复合酶制剂的酶学性质可知,以黑曲霉zju-Y1为菌株开发的复合酶制剂中各酶在40℃-60℃的反应温度范围和pH3.0-7.0范围内偏酸性环境中内均能保证较好的酶活力以及稳定性。经家禽/家畜的体外模拟消化试验后,复合酶制剂可有效提高饲料消化率,与a-半乳糖苷酶单酶添加相比较,对寡糖的降解更具优势。


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