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乳与乳制品中主要乳清蛋白组分的定量分析检测方法研究

张京顺  
【摘要】:乳清蛋白作为蛋白质源和他特有的生物学功能,被广泛应用于乳制品和配方食品中,在这些食品加工过程中一般会使用不同程度的热处理。而这些热处理过程不可避免地会导致乳清蛋白主要功能性组分α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白等发生变性,其变性程度在很大程度上依赖于热处理的时间和温度。热处理变性导致乳清蛋白中的生物活性性组分的活性损失甚至丧失,因而会影响人体对乳制品中α-乳白蛋白等主要功能性乳清蛋白组分的生物利用率。现有的检测方法由于操作繁琐检测周期长,且分离度较差不能准确定量,无法对产品中的乳清蛋白组分进行有效准确的评价。因此有必要建立分别可以检测主要功能性乳清蛋白组分的方法,为准确评价乳制品中有效营养价值提供参考依据和准确的检测方法。 本课题应用超高效液相色谱-质谱联用仪,建立了分别检测乳与乳制品中非变性α-乳白蛋白和非变性β-乳球蛋白的方法,两个方法分别以人乳a-乳白蛋白作为内标和空白基质加标进行定量以尽可能降低基质干扰的影响,分别为以0.1%三氟乙酸水溶液/乙腈溶液作为流动相,经梯度洗脱后,进入质谱采用选择区间扫描方式进行定量检测。其各自的选择扫描区间分别为α-牛乳白蛋白:2357-2368m/z;人乳α-乳白蛋白内标:2340-2350m/z;p-牛乳球蛋白A:1525-1535m/z;p-牛乳球蛋白B:1518-1528m/z。在2-50μg/mL浓度范围内,两个方法都具有良好的线性关系,相关系数均0.999,两个方法在高、中、低三个浓度水平,其平均回收率分别为95.33-98.67%(RSD%6.41)、95.14-98.15%(RSD%7.64)和94.28-98.70%(RSD%4.53)。将其应用于实际样品检测以进一步检验所建立方法的适用于与有效性结果表明,所建立的方法可适用于婴幼儿食品和乳制品中非变性牛乳α-乳白蛋白和牛乳β-乳球蛋白A和牛乳β-乳球蛋白B的定量测定。 本研究建立了在肽水平上分别用于检测总a-乳白蛋白、总牛乳铁蛋白和总牛乳p-乳球蛋白的方法。将三种蛋白分别用牛胰蛋白酶酶解后,选择优化其各自的特异标签肽,设计合成适当的内标物,使其具有与蛋白本身相似的酶解效率和色谱质谱行为。通过蛋白与标签肽之间的等摩尔定量关系,实现在肽水平上对蛋白进行准确定量,并对所建立的方法分别进行了方法学验证,三个方法的平均回收率分别在95.8-100.6%(RSD%5.1%).92.04-100.67(RSD%8.6%)和92.04-109.91%(RSD%11.2%)之间。将其应用于实际样品检测以进一步检验其适用于与有效性。本法具有灵敏度和准确度高,重现性好,处理简便的优点,本方法可用于婴幼儿食品和乳制品中总的(热变性和非变性的)牛乳α-乳白蛋白、牛乳铁蛋白和牛乳β-乳球蛋白的定量测定。


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