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近江牡蛎抗类立克次体感染天然免疫分子的生物学研究

许婷  
【摘要】:2007年2月底至5月底广西养殖的近江牡蛎发生了大面积的死亡,波及广西所有牡蛎养殖区,造成巨大的经济损失。本研究针对此次发病进行了广泛的流行病学调查和取样研究,发现类立克次体的大量感染,造成严重的牡蛎组织病理损伤。我们对该病原进行了组织病理学和超微病理学的研究,并成功地完成了病原的分离纯化和鸡胚培养。 在此基础上,为了进一步探讨近江牡蛎抗感染免疫防御反应相关机制,为其病害防治提供理论依据,我们构建了类立克次体刺激后近江牡蛎血淋巴细胞cDNA文库,随机挑选400个阳性克隆进行测序分析,共获得200个基因序列,包括96个已知序列和104个未知序列。其中96个已知基因序列根据其参与的生物学过程大致可分为11类。并从中筛选同种异体移植炎症因子(Ca-AIF1),高迁移率族蛋白(Ca-HMGB)和三个亲环蛋白家族基因(Ca-CyPA, Ca-CyPB和Ca-PPIL3),三个补体样基因片段(CaClql, CaClq2and CaC3)共8个基因,运用免疫学、分子生物学和细胞生物学等技术手段结合生物信息学知识,进行了结构分析和相关功能探讨,具体如下: 1、Ca-AIF1编码139个氨基酸,包含典型的钙结合EF-hand结构域。同源性比较结果显示Ca-AIF1与其他物种AIF1氨基酸序列相似度为47%-73%。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌中成功诱导表达及纯化了Ca-AIF1蛋白并制备了多克隆抗体。Real-time RT-PCR检测组织表达结果表明Ca-AIF1在所有被检组织中均有表达,并且在血淋巴细胞,鳃和性腺组织中表达量显著高于其他组织,预示着该基因可能参与机体免疫防御反应和生殖细胞的增殖分化。进一步免疫荧光检测组织细胞定位结果显示Ca-AIF1主要定位于性腺组织的上皮组织细胞中。随后我们使用real-time RT-PCR和流式细胞仪分析和探讨Ca-AIF1及其抗体在近江牡蛎抗感染免疫反应中的作用和机制。结果显示(1)RLO或LPS (RLO/LPS)刺激后,近江牡蛎单层血淋巴细胞中Ca-AIFl mRNA表达量显著上调,预示着Ca-AIF1参与近江牡蛎免疫炎症反应;(2)纯化的Ca-AIF1重组蛋白能够引起LITAF,Myd88,TGF β显著上调,预示着Ca-AIF1蛋白具有促炎细胞因子作用,能够引起近江牡蛎免疫炎症反应及可能的Myd88介导的信号通路;(3)制备的Ca-AIF1多克隆抗血清能够显著降低RLO/LPS刺激引起的LITAF表达量上调比例,表明Ca-AIF1抗血清能够显著抑制RLO或LPS刺激引起的免疫炎症反应;(4) Ca-AIF1多克隆抗血清能够有效降低RLO/LPS刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞坏死和晚期凋亡比率,提高细胞存活率,进一步表明近江牡蛎AIF1抗体能够有效保护机体抵御革兰氏阴性菌和RLO的感染。 2、Ca-HMGB编码203个氨基酸。包含两个典型HMG-box和一个酸性C末端。同源性比较结果显示Ca-HMGB与其他物种HMGB氨基酸序列相似度为34%-55%。Real-time RT-PCR检测组织表达结果表明Ca-HMGB在所有被检组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中的表达量显著高于其他组织,预示着该基因可能参与机体免疫防御反应。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌成功诱导表达及纯化了Ca-HMGB蛋白并制备了多克隆抗体。运用细胞免疫荧光技术检测RLO刺激前后Ca-HMGB亚细胞定位结果表明,Ca-HMGB在健康近江牡蛎血淋巴细胞的细胞核与细胞质中均有表达,而当RLO刺激12h后Ca-HMGB主要在细胞质中表达。随后我们运用real-time RT-PCR, western blot和流式细胞仪分析和探讨Ca-HMGB及其抗体在近江牡蛎抗感染免疫反应中的作用和机制,结果显示(1)RLO/LPS刺激后,近江牡蛎单层血淋巴细胞中Ca-HMGB mRNA表达量显著上调;(2)RLO刺激后,Ca-HMGB蛋白能被释放到细胞外,参与免疫炎症反应;(3)纯化的Ca-HMGB重组蛋白能够引起除AIF1外,被检测的细胞因子LITAF, Myd88, TGF βmRNA表达显著上调,预示着Ca-HMGB蛋白具有促炎细胞因子作用,能够引起近江牡蛎免疫炎症反应及可能的Myd88介导的信号通路;(4)Ca-HMGB多克隆抗血清能够显著降低RLO/LPS刺激引起的LITAF表达量上调比例,表明Ca-HMGB抗血清能够显著抑制RLO或LPS刺激引起的免疫炎症反应;(5)Ca-HMGB多克隆抗血清能够有效降低RLO/LPS刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞坏死和晚期凋亡比率,提高细胞存活率,进一步表明近江牡蛎HMGB抗体能够有效保护机体抵御革兰氏阴性菌和RLO的感染。 3、亲环蛋白基因Ca-CyPA编码165个氨基酸,Ca-CyPB编码217个氨基酸,而Ca-PPIL3编码162个氨基酸。其预测氨基酸序列均包含典型的CyP-PPIase结构域及其特征序列,而Ca-CyPB还包含一个N端信号肽序列。同源性分析结果表明近江牡蛎三个亲环蛋白间的氨基酸序列相似度为35%-48%,而Ca-CyPA与其他物种CyPA氨基酸序列相似度为74-82%,Ca-CyPB与其他物种CyPB基因相似度为57%-70%,Ca-PPIL3与其他物种PPIL3基因相似度为71%-79%。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌中成功诱导表达及纯化了Ca-CyPA, Ca-CyPB, Ca-PPIL3蛋白,并制备了多克隆抗体。此外,我们运用real-time RT-PCR技术检测三个亲环蛋白家族组织表达及RLO刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞中的mRNA表达量变化。结果显示,Ca-CyPA、Ca-CyPB、Ca-PPIL3在近江牡蛎所有被检测的组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中表达量最高。而在RLO刺激后,三个基因表达量均显著上调,预示着Ca-CyPA、Ca-CyPB、Ca-PPIL3可能参与了近江牡蛎抵抗RLO感染的免疫防御体系。 4、三个补体相关基因CaClql, CaClq2和CaC3片段中CaClql和CaClq2包含特征性C1q结构域,属于ClqDC家族蛋白,CaC3包含特征性AA2M_recep和C345C结构域,属于C3样蛋白。我们运用real-time RT-PCR技术检测三个补体相关基因片段组织表达及RLO刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞中的nRNA表达量变化。结果表明CaClql, CaClq2和CaC3在近江牡蛎所有被检测的组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中表达量最高。而在RLO刺激后,三个基因表达量均显著上调,预示着CaClql, CaClq2和CaC3可能参与了近江牡蛎抵抗RLO感染的免疫防御体系。


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