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几种动物抗原在家蚕体内表达及shRNA体内外表达提高家蚕对核型多角体病毒抗性的研究

Bhaskar Roy(若伊)  
【摘要】:家蚕是一种草食性的鳞翅目昆虫,主要以桑叶为食。遍布全球的养蚕业以蚕丝生产为主。家蚕适宜于大规模饲养,价格相对低廉,遗传背景清楚,形状变异类型多,已成为仅次于果蝇的模式昆虫,广泛应用于遗传学、生理学、病理学、分子生物学研究,并作为外源蛋白表达、药物筛选和环境安全检测等的良好工具。 养蚕业每年都会因感染核型多角体病而遭受严重的损失,这种疾病由家蚕核型多角体病毒(BmNPV)引起。虽然人们做出了很大的努力来对抗这种病毒,但是并没有良好效果。因此本文的第一部分是研究靶向基因shRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和增殖的抑制作用,目的是提高家蚕对于核型多角体病毒病的抗性。设计合成针对家蚕核型多角体病毒复制增殖相关基因p143和P35上的不同靶区域的shRNA(针对p143的5种shRNA分别为p143A, p143B, p143C, p143D,p143E,针对P35的4种分别为p35A,p35B,p35C,p35D),这些shRNA含有7-9个核苷酸的发卡结构(5’-TTCAAGAGA-3')和靶区域的19个碱基对的反义序列。合成的shRNA克隆至PXL-BACII转座子上,由BmU6启动子启动,构建成PXL-BACII-EGFP-BmU6-shRNAs重组转座载体。重组转座载体转染家蚕细胞或家蚕幼虫后,再用BmNPV感染,96小时后检测病毒表达量。结果表明:含p143E靶向基因shRNA的重组转座载体转染BmH细胞或家蚕幼虫,p143E的靶基因被抑制,致使NPV的表达量降低90%。同样在p35靶向基因shRNA的研究中,p35C对于家蚕细胞对NPV的表达量的抑制作用非常显著,约为70%。这些结果表明,不同序歹shRNA对抑制家蚕核型多角体病毒复制和增殖的效果具有明显差异,需要从大量shRNA中筛选有效的靶向基因shRNA.此外,我们还检测同时转入BmNPV禾shRNA载体的幼虫血淋巴中BmNPV多角体的密度。结果表明,转入含p35C靶向基因shRNA勺重组载体后再感染BmPV,家蚕血淋巴中多角体的量明显少于仅感染BmNPV的家蚕。基因表达量分析表明,在家蚕幼虫体内、血淋巴和BmN细胞中BmNPV基因的表达水平受到p35C的显著抑制。本研究提供了一种能有效抑制BmNPV对家蚕感染的RNAi技术,为减轻BmNPV对养蚕业的危害提供了一种新方法。 在大多数情况下,在昆虫细胞中表达的真核蛋白质的翻译后加工过程与其在哺乳动物细胞中的方法类似。猪瘟(CSFV)给养猪业都造成了巨大损失。猪瘟病毒(CSFV)E2糖蛋白是在诱导产生中和抗体保护宿主这一过程中起主要作用的蛋白质。本研究采用Bac-Bac杆状病毒表达系统成功地在家蚕细胞和幼虫中表达了CSFV的E2糖蛋白。该研究通过RT-PCR反应克隆出E2基因,将其连接到pMD18-T载体上。并将E2基因最终连接到pFastBacHTB载体,然后转化大肠杆菌E. coli DH10Bac,重组载体构建成功后转染家蚕细胞系及幼虫,SDS-PAGE和western blotting表明在重组杆状病毒rBacmid/BmNPV/E2的家蚕血液中成功表达出了分子量大约39.6kDa的条带,大小与推测的E2糖蛋白一致。这些结果表明杆状病毒表达系统可以作为研究抗猪瘟病毒药物的有效方式。 此外,我们从猪体内克隆INF γ口E2基因,并将这两种基因克隆到pFastBacHTb载体,在大肠杆菌E.coli DH10Bac/BmNPV中,构建成重组病毒rBacmid/BmNPV/E2-INFγ。当重组病毒感染家蚕幼虫时,表达出了大小为59kDa的融合蛋白,它同时包含E2和INFγ两个亚基。证明了杆状病毒表达系统可以用来生产抗CSFV病毒的亚基疫苗或抗原,这将有利于对猪瘟病毒的发病机理和治疗方法的研究。


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